董源，湯靈玲，林林，盧山

南京師范大學生命科學學院 江蘇省分子醫(yī)學生物技術重點實驗室，江蘇 南京 210046

蛋白質(zhì)定量檢測是生命科學研究領域廣泛涉及的重要生物化學分析內(nèi)容。多年以來，盡管有先進的蛋白檢測方法如質(zhì)譜、熒光分析等[1-2]在不斷發(fā)展，而福林酚試劑 (Folin-Ciocalteu’s reagent)、二辛可寧酸 (Bicinchoninic acid，BCA)和考馬斯亮藍 G-250 (Coomassie brilliant blue G-250，CBB，也被稱作Bradford) 等仍然是最常規(guī)使用的比色測定方法[3]。這些方法是利用氧化還原反應產(chǎn)物或者染料-蛋白質(zhì)絡合物的顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度間存在的線性關系而繪制標準曲線來測定樣品中可溶性蛋白濃度的，但在實際應用中，常常會因為多種化學物質(zhì)干擾而影響檢測結果，導致使用局限[4]。

例如，福林酚試劑法會受到表面活性劑、金屬離子螯合劑、還原劑及含氮化合物[5-6]等的嚴重干擾；BCA方法雖然受表面活性劑影響小，但對金屬離子螯合劑、還原劑等的存在很敏感[5]；CBB法與福林酚試劑法類似，對表面活性劑的耐受性差[7]，所以這些方法總會因為蛋白質(zhì)測定液中非蛋白組分的存在而影響蛋白質(zhì)含量的精確測定，具體使用時，通常需要針對不同的干擾物質(zhì)選用不同的測定方法。如果蛋白液中存在表面活性劑，可以選用BCA方法檢測蛋白質(zhì)含量；而蛋白溶液中含有金屬離子螯合劑，就需要替換為CBB法檢測蛋白質(zhì)含量。這樣，不僅給蛋白質(zhì)含量檢測帶來操作上的不便，也使得不同溶液中蛋白質(zhì)含量的比較分析成為困難，還可能對后續(xù)實驗的可靠性產(chǎn)生影響，因此，人們總希望能夠找到好方法解除干擾。有研究針對某些特定的樣品如骨骼肌[8]，或某些特定操作如聚丙烯酰胺雙向凝膠電泳[9]，探討適宜的檢測方法；也有文獻報道，通過檢測850 nm吸收值對CBB法進行藥液蛋白質(zhì)含量分析中羧乙烯聚合物 (Carbopol) 產(chǎn)生的干擾進行校正[10]；而含糖蛋白溶液則可以通過蛋白質(zhì)沉淀又溶解的方法來去除糖分導致的干擾[11]等；但迄今為止，對于多種常見的干擾物質(zhì)并沒有很好的解決辦法，所以開發(fā)簡便的受多種干擾物質(zhì)影響小的蛋白質(zhì)定量檢測方法十分必要。

本研究在廣泛使用的福林酚試劑法[12]的基礎上，重新設計制定實驗試劑的組成與配比以及操作程序，建立蛋白質(zhì)檢測新方法的同時又探討新方法發(fā)色產(chǎn)物的優(yōu)選檢測波長以及穩(wěn)定性，還分析新方法對多種常見干擾物質(zhì)的包容性，能夠為蛋白質(zhì)的快速準確定量提供方便。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin，BSA)、苯甲基磺酰氟 (Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF) 從Sigma公司購入，蛋白酶抑制劑混合物 (Protease inhibitor cocktail，PIC) 購自Roche公司。聚乙二醇辛基苯基醚 (Triton X-100)、?-巰基乙醇 (?-Mercaptoethanol，?-ME)和乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA·Na2，EDTA) 購自Amresco公司。二硫蘇糖醇 (Dithiothretol，DTT)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸 (Ethylene glycol bis (2-aminoethyl) tetraacetic acid，EGTA)、硫酸銨(Ammonium sulfate，(NH4)2SO4) 和尿素 (Urea)購自Bio Basic公司。福林酚試劑由上海荔達生物科技公司出品。細胞培養(yǎng)用胎牛血清 (Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)為PAA Laboratories公司生產(chǎn)，低限基本培養(yǎng)基 (Minima essential medium，MEM) 粉末購自GIBCO公司。十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)、釩酸鈉 (Na3VO4)等其他常用試劑購自國藥集團。

1.1.2 主要儀器

CO2細胞培養(yǎng)箱 (Thermo Scientic公司)，酶標儀(Bio-TEK公司)，小型渦旋器。

1.2 方法

1.2.1 標準樣品的制備

稱取一定量 BSA溶解于蒸餾水中，調(diào)配終濃度為4 g/L，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動物細胞裂解液的制備及干擾物質(zhì)的添加

細胞全蛋白待測樣品是通過裂解液收集、破碎細胞而獲取的上清液[13]，因此細胞蛋白質(zhì)含量測定中的非蛋白干擾物質(zhì)主要來源于裂解液組分 (細胞體積可忽略不計)，細胞裂解液里添加的干擾成分的含量即為待測樣品干擾物質(zhì)的濃度。首先制備 10倍基本裂解液 (200 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)，1.5 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA和10% SDS)，保存于-20 ℃。使用前冰上稀釋，并根據(jù)實驗要求分別添加不同含量的各種干擾組分如DTT或者β-ME等，以及1 mmol/L Na3VO4，1 mmol/L PMSF和1×PIC。當討論表面活性劑對蛋白測定的干擾時，基本裂解液組成不包含SDS，而各表面活性劑濃度按照具體實驗設計要求添加。

1.2.3 動物細胞培養(yǎng)及全蛋白提取

將 1.5×106人前列腺癌細胞 PC-3接種于10 mL含5% FBS-MEM培養(yǎng)基的100 mm細胞培養(yǎng)皿，在5% CO2，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，生長至50%飽和以上時，用4 ℃預冷的PBS(-)洗滌2次后，加入500 mL預冷的PBS (-)，然后用刮棒冰上收集細胞，并平均分配細胞液于1.5 mL離心管，4 ℃、10 000×g離心10 min，去上清，再移入包含不同成分的細胞裂解液，渦旋振蕩，放置冰上30 min，重復離心操作，收集上清液用于蛋白質(zhì)含量測定，也可以放置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 蛋白定量新方法及標準曲線的建立

分別配制A貯存液 (含1.89 mol/L碳酸鈉和1 mol/L 氫氧化鈉)，B貯存液 (含0.25% 酒石酸鈉 (W/V)、0.125% 硫酸銅 (W/V) 和 2.5% SDS (W/V)) 及C發(fā)色液 (為2 mol/L福林酚原液的10倍稀釋液，用HCl調(diào)整pH至1) 于室溫下存放。

將 BSA標準蛋白溶液按照二倍稀釋法用蒸餾水稀釋至最低濃度為0.0625 g/L的7個梯度濃度，分別取5 mL BSA標準溶液各梯度樣品放入96孔細胞培養(yǎng)板中；每個標準樣品至少有3個重復樣，空白對照為同體積的蒸餾水；然后加入25 mL工作液 (臨用前混合50個體積A貯存液與1個體積B貯存液)。再加入200 mL發(fā)色液，混合均勻，室溫下放置 30 min，利用酶標儀在570~630 nm范圍任一波長下測定吸光值。獲取數(shù)值后輸入Excel軟件，橫坐標為標準樣品濃度，縱坐標為對應吸光值，然后添加趨勢線，獲得線性回歸方程及線性相關系數(shù)。另外，將標準樣品連續(xù)放置0.3、1、2、4、8、24 h后在630 nm波長下檢測吸光值，用于比較標準曲線的穩(wěn)定性。

1.2.5 蛋白定量新方法對干擾物質(zhì)的耐受性分析

進行標準曲線實驗的同時，將與標準蛋白溶液同樣體積的0.1~4 g/L濃度區(qū)間的細胞蛋白樣品也加入96孔板中，每個待測樣品至少有3個重復樣；然后每個樣品添加25 mL工作液，最后加入 200 mL發(fā)色液，混合均勻，室溫下放置30 min，利用酶標儀在590 nm波長下測定吸光值。獲得數(shù)值后繪制標準曲線，并獲取線性回歸方程，再將待測樣品吸光值導入標準曲線回歸方程計算樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.2.6 統(tǒng)計方法

2 結果與分析

2.1 不同吸收波長下的BSA標準曲線和發(fā)色產(chǎn)物穩(wěn)定性的比較

以 BSA為標準樣品，分別在 570、595或630 nm波長下繪制的標準曲線如圖1所示，其相應的線性相關系數(shù)平方 (R2) 值分別為 0.998、0.998或 0.997，均大于通常標準曲線要求的 R2值 (0.996)[14]，說明用該標準品作標準曲線，所求的回歸方程是有意義的，且在上述波長范圍均可用作新方法的檢測波長，其中595 nm處獲得的標準曲線的吸光值最大，為優(yōu)選波長。此外，630 nm波長下最高濃度標準樣品的吸光值隨時間變化的曲線如圖2所示，可以看出4 h內(nèi)幾乎沒有變化，8 h后下降約1.8%，24 h后下降14%，說明新方法獲得的發(fā)色產(chǎn)物在數(shù)小時內(nèi)顏色基本能夠保持恒定。

2.2 表面活性劑對細胞蛋白質(zhì)含量測定的影響

細胞裂解液中 SDS含量不斷上升時，新方法對蛋白質(zhì)濃度測量結果見圖3A。SDS含量即使高達10%，細胞全蛋白濃度也幾乎沒有變化。

圖1 蛋白質(zhì)定量檢測的BSA標準曲線Fig. 1 BSA standard curves for protein assay.

圖2 發(fā)色產(chǎn)物最大吸光值24 h內(nèi)的變化Fig. 2 Time course for maxi-Absorbances during 24 h.

圖3 表面活性劑存在下細胞全蛋白含量的檢測Fig. 3 Protein assay for cell lysates in the presence of 3 surfactants, respectively. (A) Lysis buffer containing SDS. (B) Lysis buffer containing NP-40 or TritonX-100.

如果采用其他的常用表面活性劑TritonX-100或 NP-40來處理細胞，則蛋白質(zhì)濃度測量結果的變化見圖3B，當TritonX-100含量小于或等于1%，NP-40含量小于或等于2%，對蛋白定量沒有明顯的影響。

2.3 金屬離子螯合劑對細胞全蛋白定量的影響

不同濃度金屬離子螯合劑EDTA或EGTA存在下，新方法對細胞蛋白質(zhì)濃度的檢測結果如圖4所示，50 mol/L EDTA使蛋白質(zhì)濃度顯著降低，而2 mmol/L EGTA使蛋白質(zhì)濃度下降了42%。但是EDTA與EGTA濃度分別為25 mmol/L或1 mmol/L及以下則對蛋白質(zhì)檢測沒有明顯干擾。

圖4 金屬離子螯合劑存在下全蛋白含量的檢測Fig. 4 Protein assay for cell lysates in the presence of chelators, respectively. (A) EDTA. (B) EGTA.

2.4 還原劑對細胞全蛋白定量的影響

新方法對含有不同濃度DTT或β-ME的細胞蛋白裂解液進行的定量測定結果見圖5，可以看出樣品溶液中包含DTT或β-ME在1 mmol/L及以下對蛋白質(zhì)濃度檢測沒有顯著影響。

圖5 還原劑存在下全蛋白含量的檢測Fig. 5 Protein assay for cell lysates in the presence of reductants, respectively. (A) DTT. (B) β-ME.

2.5 含氮物質(zhì)對細胞全蛋白定量的影響

常用的含氮物質(zhì)硫酸銨和尿素存在時，細胞蛋白定量的結果如圖 6所示，蛋白質(zhì)溶液中硫酸銨含量小于或等于0.5 mol/L，或尿素含量小于或等于 4 mol/L 對蛋白質(zhì)檢測不會造成顯著干擾。

圖6 含氮化合物存在下全蛋白含量的檢測Fig. 6 Protein assay for cell lysates in the presence of nitrogen-containing compunds, respectively. (A) (NH4)2SO4. (B) Urea.

3 討論

福林酚試劑法是1951年Lowry等[15]在雙縮脲反應基礎上，引入福林酚試劑來擴大反應信號的蛋白質(zhì)含量檢測方法，因此又被稱作 Lowry法。主要依據(jù)是利用堿性條件下Cu2+與肽骨架的-CO-NH-基團形成的藍色絡合物將鱗鎢酸和鱗鉬酸還原為鎢和鉬藍而進一步呈色的結果[16]。常用的試劑組成如表1所示，首先使蛋白質(zhì)樣品置于堿性環(huán)境，然后與CuSO4試劑混合，室溫放置約15 min，再加入福林酚試劑放置45 min，660 nm波長下測定吸光值。此方法的主要缺點是對許多干擾物質(zhì)的包容性差，如表面活性劑TritonX-100或 SDS含量僅達1%，金屬離子螯合劑EDTA濃度達到10 mmol/L，尿素含量達3 mol/L，或硫酸銨含量達3% (約0.227 mol/L)，以及還原劑如硫醇等的存在就會嚴重干擾測試結果[5-6,17]。

表1 比較新方法與目前常用的福林酚法試劑配比及組成Table 1 Comparison for reagent components between new and Folin-Ciocalteu’s reagent protein assay

長久以來，有相關文獻報道對此方法在不同領域的應用進行改良[18-20]，有的增加了操作的復雜性，但效果仍然有限。本研究探討的新方法沒有對原方法繁雜化，且將 SDS耐受性提高了約10倍。實驗中SDS濃度沒有進一步增加，是因為待測樣品溶液的粘度隨著 SDS濃度的上升而不斷增加，幾乎已達到操作的極限，這應該是SDS作為表面活性劑在溶液中的增稠作用所導致的。另外，少量TritonX-100和NP-40也不影響測定結果，可見新方法對表面活性劑的包容性明顯增加，這可能與B貯存液中添加的少量SDS有關聯(lián)[21]。

新方法對金屬離子螯合劑 EDTA耐受濃度增加1倍以上，這可能是因為B貯存液的Cu2＋濃度顯著降低而減少了工作液中螯合劑能夠結合的底物，因此提高了對螯合劑的包容性。

同時，新方法對還原劑DTT和β-ME均顯示出一定的耐受性；對含氮化合物如硫酸銨的包容性增加2倍，對尿素的耐受性也有所提高，但相關機理不清楚。這可能是新方法顯著增強蛋白質(zhì)樣品在未加入福林酚試劑前的堿性環(huán)境，使 Cu2+與肽骨架的-CO-NH-基團形成的藍色絡合物反應更完全的影響；而且我們實驗使用的蛋白質(zhì)含量檢測范圍明顯高于常用福林酚試劑法的5~100 mg/L[12]，因此新方法對干擾物質(zhì)包容性的增強也可能與檢測靈敏度的變化相聯(lián)系，需要將來進一步分析驗證。此外，本實驗僅以細胞裂解液為測定樣品，沒有嘗試其他蛋白樣品的檢測，也沒有針對福林酚試劑法的其他干擾成分如糖類、氨基酸及多肽的影響進行探討，因此新方法的適用范圍等還有待深入研究。

綜上所述，新方法操作簡單、迅速，實驗結果重復性好，穩(wěn)定性高，檢測范圍0.1~4 g/L，對多種常見干擾成分具有較好的包容性，如表2所示，適用不同裂解液制備的細胞蛋白檢測，在生命科學研究領域應具有廣泛應用前景。

表2 新方法對常見干擾物質(zhì)的最大耐受濃度Table 2 Highest levels for interferences used in new assay

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