郭春，林蕾，任妮妮，姜軻冉，袁海霞，余旭平

浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動物病毒學(xué)重點實驗室，浙江 杭州 310058

基因敲除是后基因組時代基因功能研究的最有效手段之一，而載體是基因敲除工作的工具和核心[1]。2010年李軍華等[2]以pBS246質(zhì)粒為骨架，在該質(zhì)粒的兩個LoxP序列之間插入正篩選標(biāo)記基因，并在兩個LoxP序列外側(cè)分別插入兩組攜帶“8 堿基”酶切位點的多克隆位點序列(MCS-1和MCS-2) 和負(fù)篩選標(biāo)記基因，成功構(gòu)建了通用型基因打靶載體 pGT-V1，該載體的構(gòu)建為有效開展基因打靶提供了新的平臺。同年姜娜等[3]通過構(gòu)建打靶載體pHY-Kan-ssaV，成功敲除了傷寒沙門氏菌S.ty2的ssaV基因，獲得傷寒沙門氏菌 ssaV基因缺失株?；蛉笔е甑臉?gòu)建是研究病原微生物致病機(jī)理的重要手段[4]，通過構(gòu)建致病菌的基因缺失株并分析其表型[5]，有助于快速了解致病基因功能和致病機(jī)制。2007年喬鳳等[6]在pUC19質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，在其多克隆位點處插入卡那霉素抗性基因，并在該基因兩側(cè)添加多個酶切位點，成功構(gòu)建了pUC19K質(zhì)粒。作者進(jìn)一步利用該自殺質(zhì)粒構(gòu)建了布魯氏菌外膜蛋白 Omp25基因突變株，為細(xì)菌基因功能研究奠定基礎(chǔ)。2011年胡勇等[7]以pMD18-T為載體，利用交錯PCR技術(shù)構(gòu)建了傷寒沙門氏菌bcfD基因敲除突變株，為進(jìn)一步研究 bcfD的基因功能提供有效的技術(shù)手段。

基因敲除方法很多，插入復(fù)制突變法(Insertion duplication mutation，IDM) 是其中一種簡單高效的基因敲除和基因功能研究方法[8-9]。IDM是利用克隆于載體中的DNA片段與基因組中的相應(yīng)基因同源重組，插入另一拷貝DNA片段和質(zhì)粒骨架，導(dǎo)致重組菌中相應(yīng)基因被截斷而敲除。IDM可以用于基因功能的鑒定，包括細(xì)菌基因的必需性鑒定。2004年Knuth 等[8]采用IDM方法鑒定出鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028的 257個必需基因，該方法構(gòu)建了一個帶溫度敏感復(fù)制子的pIDM1質(zhì)粒，它在37 ℃時不能復(fù)制；利用該載體的 KpnⅠ位點，Knuth等[8]克隆了基因組隨機(jī)PCR (rPCR) 產(chǎn)物，構(gòu)建了鼠傷寒沙門氏菌本菌株基因組文庫。通過細(xì)菌培養(yǎng)溫度的改變，篩選出發(fā)生了同源重組并插入 pIDM1骨架 (含tet基因) 的重組菌。由于必需基因的IDM敲除菌株不能存活，理論上不能通過培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)換而篩選到重組菌 (實際上因非同源重組、突變等原因，仍可能篩到極少量的四環(huán)素耐藥菌株)，而非必需基因的敲除不影響細(xì)菌的生存，因此能篩選到大量的重組菌，計算重組率 (Integration rate per cell，IPC) 可以了解基因的必需性[9]。2007年，Klumpp等[10]還進(jìn)一步測定經(jīng)pIDM1質(zhì)粒突變的菌株在巨噬細(xì)胞中的存活情況，篩選獲得與巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制相關(guān)的致病基因。

pIDM1是一個有效的基因敲除載體，但pIDM1質(zhì)粒需要經(jīng)KpnⅠ等單酶切，并需進(jìn)一步脫磷處理以避免自身環(huán)化，操作較繁瑣，成功率低；另一方面，PCR產(chǎn)物也需首先經(jīng)過酶切，而不能進(jìn)行直接克隆。為此，本實驗擬在 pIDM1的基礎(chǔ)上，在EcoRⅠ和PstⅠ位點間插入XcmⅠ接頭，構(gòu)建可以直接克隆PCR產(chǎn)物的T載體，進(jìn)一步應(yīng)用構(gòu)建的T載體進(jìn)行雞白痢沙門氏菌2個基因的敲除和必需性檢測，驗證該載體的有效性。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

基因工程宿主菌E. coli TG1由本實驗室保存；質(zhì)粒pIDM1 (溫度敏感、tet抗性) 由德國博士Fuchs TM (Zentralinstitut für Ern?hrungs-und Lebensmittelforschung (ZIEL) ， Abteilung Mikrobiologie，Technische Universit?t München)饋贈；雞白痢沙門氏菌CVCC527菌株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 試劑和工具酶

EcoRⅠ、PstⅠ等限制性內(nèi)切酶和rTaq DNA聚合酶、dNTPs Mix購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶和 XcmⅠ內(nèi)切酶購自 New England Biolabs；DNA marker (DL5000、DL2000) 購自東盛公司；AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒、PCR清潔試劑盒均購自Axygen公司；血液/細(xì)胞/基因組DNA提取試劑盒購自北京博大泰克生物有限公司；基因片段引物及接頭引物的合成在南京金思瑞生物有限公司完成，測序由華大基因科技股份有限公司完成。

1.3 引物

本實驗所用引物名稱及序列見表1。

1.4 pIDM-T質(zhì)粒的構(gòu)建

1.4.1 XcmⅠ接頭引物的設(shè)計與合成

參照文獻(xiàn)[11]設(shè)計一對接頭引物 XcmⅠ-up和 XcmⅠ-dn，并在上下游引物的兩端分別增加EcoRⅠ位點和PstⅠ位點 (表1)，以便克隆入質(zhì)粒pIDM1的EcoRⅠ位點和PstⅠ位點間，引物由南京金思特有限公司合成。

1.4.2 接頭的退火、酶切與純化

取XcmⅠ-up、XcmⅠ-dn (10 μmol/L) 各10 μL混合，100 ℃下煮沸5 min，緩慢冷卻至室溫，得到雙鏈接頭。對接頭進(jìn)行EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切并純化回收。

1.4.3 pIDM1質(zhì)粒的雙酶切

用EcoRⅠ和PstⅠ對pIDM1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切并回收。

1.4.4 連接

將上述回收的接頭酶切產(chǎn)物與 pIDM1/ EcoRⅠ/PstⅠ酶切產(chǎn)物于16 ℃連接，轉(zhuǎn)化E. coli TG1并篩選得到重組質(zhì)粒pIDM-T。用限制性內(nèi)切酶 XcmⅠ對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證和測序分析，測序由華大基因科技股份有限公司完成，測序引物為M13F。1: the EcoR I and the Pst I sites are underlined and the two Xcm I sites are boxed in the Xcm I adapter; 2: the position of the eno and ybdr primers corresponding to the genome sequence of Salmonella gallinarum str. 287/91 (GenBank Accession No. NC_011274.1); 3: the position of universal primers on the constructed pIDM-T vector referred to the Xcm I cassette (for m13F-47up and M13F: upstream of the Xcm I cassette, for m13R-Mdn: downstream of the Xcm I cassette); 4: the theoretically calculated length of DNA fragments amplified together with m13R-Mdn, respectively; 5: the length of DNA amplified from the pIDM-T vector with no insertion.

表1 引物名稱及序列Table 1 Names and sequences of primers

1.5 選定基因pIDM-T敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

1.5.1 目的基因的選取

根據(jù)DEG必需基因庫 (Database of essential genes) 已有信息和文獻(xiàn)報道[8,10,12-13]，選取 2個雞白痢沙門氏菌基因eno和ybdr作為目標(biāo)敲除基因。eno在DEG庫的多種細(xì)菌中均為必需基因，ybdr在PEC (Profiling of E. coli Chromosome) 數(shù)據(jù)庫上公布為大腸桿菌的非必需基因，且在本實驗室前期雞白痢沙門氏菌必需基因片段篩選工作中驗證為非必需基因。

1.5.2 引物設(shè)計與合成

從NCBI上公布的雞傷寒沙門氏菌基因組序列中，獲得選定基因的序列，并應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計引物：eno-up和eno-dn，ybdr-up和ybdr-dn，引物序列見表1，引物由南京金思瑞生物有限公司合成。

1.5.3 目的基因片段的擴(kuò)增與克隆

以S. Pullorum基因組DNA為模板，用上述設(shè)計的引物擴(kuò)增出目的基因片段，將純化后的基因片段與經(jīng)純化的pIDM-T/XcmⅠ載體進(jìn)行16 ℃連接12~14 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1。

1.5.4 陽性克隆篩選

在pIDM-T質(zhì)粒中具有M13通用引物結(jié)合位點，因此選擇合成 m13F_47up與 m13R_M-dn引物 (表 1)，用于轉(zhuǎn)化克隆的菌落 PCR鑒定。取大腸桿菌轉(zhuǎn)化子稀釋液為模板，用上述通用引物進(jìn)行菌落 PCR檢測，篩選陽性克隆 (空載體PCR產(chǎn)物長度為305 bp)，進(jìn)一步抽提陽性克隆質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定和測序驗證。

1.6 pIDM-T質(zhì)粒復(fù)制溫敏特性的測定

pIDM-T質(zhì)粒是在pIDM1基礎(chǔ)上插入XcmⅠ位點構(gòu)建而成的，理論上它與pIDM1質(zhì)粒一樣，在30 ℃培養(yǎng)時正常復(fù)制，在37 ℃培養(yǎng)時質(zhì)粒因不能復(fù)制而逐步在子代細(xì)胞中丟失，新的細(xì)胞將因tet抗性基因丟失而無法在tet平板上存活，只有重組菌因基因組中整合了一拷貝的質(zhì)粒 (含tet抗性基因) 而能在37 ℃平板上生長。為驗證上述推論，以排除因質(zhì)粒未完全丟失而對IPC值測定的影響，我們開展了如下實驗：將pIDM-T空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化雞白痢沙門氏菌527菌株，挑選陽性轉(zhuǎn)化克隆，30 ℃過夜培養(yǎng)，將過夜培養(yǎng)物稀釋后涂布四環(huán)素抗性平板，37 ℃培養(yǎng)24~48 h，同時以克隆有非必需 ybdr基因片段的 pIDM-T_ybdr重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌為陽性對照，觀察細(xì)菌 (重組菌落) 的生長情況。

1.7 IPC值計算及基因的必需性鑒定

將抽提的陽性質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化至527菌株感受態(tài)細(xì)胞，涂布含四環(huán)素的 LB平板，30 ℃培養(yǎng)24~48 h。挑取單個陽性克隆接種于含四環(huán)素的SOC液體培養(yǎng)基中，30 ℃溫和振蕩培養(yǎng)20~24 h。

為使計數(shù)更加精確和方便，對稀釋方法進(jìn)行了摸索。對30 ℃培養(yǎng)條件下的細(xì)菌總數(shù)計數(shù)，嘗試了104、105、106、107、108等多個稀釋梯度；對37 ℃條件下的重組菌計數(shù)，我們進(jìn)行過2倍、3倍、4倍稀釋，比較各個梯度菌液在平板上的生長情況，確定最佳稀釋倍數(shù)。據(jù)前期的摸索用96 孔板將菌液稀釋為30倍和120倍，并將稀釋菌液50 μL涂布于含四環(huán)素的LB平板，每個稀釋度做3次重復(fù)，將平板置于37 ℃培養(yǎng)24~48 h，計數(shù)重組菌的數(shù)量。同樣再用 96孔板將菌液稀釋為105和106倍，將稀釋菌液50 μL涂布于含四環(huán)素的LB平板，每個稀釋度做3次重復(fù)，并將平板置于30 ℃培養(yǎng)24~48 h，計數(shù)菌液中的細(xì)菌總數(shù)。

根據(jù)公式 (IPC=重組子個數(shù)/細(xì)菌總個數(shù)，即37 ℃平板菌落總數(shù)/30 ℃平板菌落總數(shù)) 計算出IPC值。據(jù)文獻(xiàn)報道[8,10]，IPC≤1.0×10-6時判定目的基因為必需基因；1.0×10-4≤IPC≤1.0×10-2時判定目的基因為非必需基因。

1.8 雞白痢沙門氏菌突變株重組插入位點的鑒定

參照雞傷寒沙門氏菌基因組全序列，分別在目的基因片段的上游200 bp左右設(shè)計突變株鑒定引物eno-I-up，ybdr-I-up (表1)，將上述鑒定引物與位于pIDM-T載體上的下游引物m13R-Mdn (或上游引物m13F_47up，因T載體克隆片段時可以正反向二種方式插入) 組合，對 37 ℃條件下生長的2個菌落進(jìn)行PCR鑒定。依據(jù)能否擴(kuò)增出特異的基因片段及片段的測序結(jié)果鑒定突變株IDM插入位點的正確性。

2 結(jié)果

2.1 pIDM-T質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將XcmⅠ接頭插入pIDM1的EcoRⅠ和PstⅠ后獲得pIDM-T重組質(zhì)粒，為驗證接頭已正確插入，用XcmⅠ酶切重組質(zhì)粒，獲得1條約3.9 kb的片段；而未插入接頭的 pIDM1原始質(zhì)粒不能被XcmⅠ酶所消化 (圖1)。用引物M13-F對已構(gòu)建的pIDM-T質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果與預(yù)期一致。

圖1 pIDM-T重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 1 Gel electrophoresis of the recombinant vector pIDM-T identified by enzyme digestion. M: marker (DL5000); 1: pIDM-T digested with XcmⅠ; 2: pIDM1 digested with XcmⅠ; 3: pIDM-T plasmid.

2.2 選定基因pIDM-T敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

eno和 ybdr基因擴(kuò)增片段的預(yù)期大小分別為：429 bp和436 bp，電泳結(jié)果顯示與預(yù)期相符(圖2)。用通用引物m13F_47up與m13R_Mdn對pIDM-T載體克隆的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR檢測，理論上陽性克隆片段條帶大小為目的基因克隆片段加 300 bp (空載體擴(kuò)增出的條帶大小為305 bp)，對應(yīng)地eno、ybdr陽性克隆的擴(kuò)增長度分別約為730 bp和740 bp，電泳檢測結(jié)果與預(yù)期一致 (圖略)。提取初步鑒定為陽性克隆的質(zhì)粒，用EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切再次驗證，電泳結(jié)果可見兩條帶，小片段與插入片段大小一致 (圖3)。

2.3 pIDM-T質(zhì)粒復(fù)制溫敏特性的測定

據(jù)文獻(xiàn)報道[14]，pIDM1在沙門氏菌細(xì)胞中的質(zhì)?？截悢?shù)約為300個，盡管細(xì)菌在37 ℃培養(yǎng)時 pIDM1質(zhì)粒不復(fù)制，但它可以繼續(xù)隨細(xì)胞分裂而分配，因此，pIDM1質(zhì)?？勺疃喾峙涞?00多個子代細(xì)胞中。如果細(xì)菌基因組上沒有重組的質(zhì)?？截?，新的細(xì)菌細(xì)胞中將因質(zhì)粒丟失而無法在四環(huán)素平板上存活。pIDM-T質(zhì)粒是在pIDM1質(zhì)粒的基礎(chǔ)上插入 XcmⅠ酶切位點構(gòu)建而成的，理論上它與 pIDM1質(zhì)粒的溫敏特性是一樣的，因此，如果pIDM-T或其衍生質(zhì)粒不與基因組發(fā)生有效的重組，tet基因傳遞給子代細(xì)胞的數(shù)量是有限的。

圖2 目的片段擴(kuò)增Fig. 2 The amplification of the target genes. M: marker (DL2000); 1: amplification without template; 2: eno fragment; 3: ybdr fragment.

圖3 陽性質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig. 3 The double digestion of the target plasmid. M: marker (DL5000); 1: EcoRⅠ/PstⅠdouble digestion of pIDM-T_eno; 2: EcoRⅠ/PstⅠdouble digestion of pIDM-T_ybdr.

為驗證上述推論，在實驗時我們將pIDM-T空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化雞白痢沙門氏菌527菌株，陽性轉(zhuǎn)化菌 30 ℃過夜培養(yǎng)后稀釋涂布于四環(huán)素抗性平板，37 ℃培養(yǎng)約36 h后，觀察細(xì)菌 (重組菌落)的生長情況，發(fā)現(xiàn)在pIDM-T空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌涂布的平板上僅見到較淡的菌苔背景，無單個的重組菌落 (圖4A)；而平行開展的pIDM-T_ybdr重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌則在較淡的菌苔背景上見到明顯的重組菌落 (圖4B，黑色箭頭標(biāo)示)。

由此可見，pIDM-T質(zhì)粒在37 ℃培養(yǎng)時會逐步丟失，不會影響IPC值的測定。

2.4 IPC值計算及選定基因的必需性鑒定

將2個陽性重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化527菌株，將轉(zhuǎn)化菌株接種LB液體30 ℃增菌，菌液稀釋涂板后分別置于30 ℃和37 ℃培養(yǎng)。30 ℃培養(yǎng)用于計數(shù)菌落總數(shù)，而37 ℃培養(yǎng)用于計數(shù)重組子數(shù)。根據(jù)公式IPC=重組子數(shù)/細(xì)菌總數(shù)=37 ℃平板菌落總數(shù)/30 ℃平板菌落總數(shù)，計算得eno和ybdr的IPC值分別為1.92×10-7和1.64×10-4(表2)。從測定數(shù)值看出，eno基因片段的重組率低于1.0×10-6，鑒定為必需基因，而ybdr基因片段重組率較高，鑒定為非必需基因，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖4 pIDM-T及其衍生質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌的37 ℃平板培養(yǎng)結(jié)果Fig. 4 Growth of the transformants of pIDM-T and its derivative plasmid in 37 ℃. (A) The growth of the 527 strain with pIDM-T plasmid on tet plate after incubated in 37 ℃ for 36 hours. (B) The growth of the 527 strain with pIDM-T_ybdr plasmid on tet plate after incubated in 37 ℃ for 36 hours. Black arrows point to recombinant colonies grown on the plate.

表2 菌落計數(shù)及IPC值測定Table 2 The colony number and IPC value

2.5 雞白痢沙門氏菌突變菌株重組插入位點的鑒定

攜帶非必需的 ybdr基因片段的pIDM-T_ybdr質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至527菌株后，目的基因片段可與細(xì)菌基因組 DNA同源片段發(fā)生重組，pIDM-T質(zhì)粒骨架插入到對應(yīng)基因中，使目的基因被敲除，同時使細(xì)菌基因組中攜帶1拷貝的tet抗性基因 (原理圖見圖5)。盡管37 ℃條件下pIDM-T_ybdr質(zhì)粒不能復(fù)制，逐漸丟失，由質(zhì)粒表達(dá)的 tet抗性也隨之消失，但發(fā)生了同源重組的細(xì)菌基因組上仍含有1拷貝的tet基因，因此重組菌可以在四環(huán)素平板上存活。然而，攜帶eno基因片段的pIDM-T_eno質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至 527菌株后，因eno基因的必需性，發(fā)生特異性同源重組的菌株因eno基因的敲除而死亡，因此理論上不可能出現(xiàn)eno基因中插入質(zhì)粒骨架和tet基因的菌株。

為驗證上述分析的正確性，我們從37 ℃培養(yǎng)的pIDM-T_ybdr質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板中，隨機(jī)挑選了2個菌落，用 ybdr-I-up上游引物分別與m13R-Mdn和m13F-47up引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果用ybdr-I-up與m13R-Mdn引物組合時擴(kuò)增出約750 bp的片段，ybdr-I-up與m13F-47up引物組合擴(kuò)增無產(chǎn)物 (圖 6)。對擴(kuò)增出的約750 bp的片段進(jìn)行測序，結(jié)果顯示該片段含有一段ybdr基因序列和小段載體序列 (144 bp)，與預(yù)期一致，說明構(gòu)建的SalΔybdr 527突變株是由于pIDM-T載體克隆的ybdr基因片段經(jīng)IDM方式特異性地同源重組的結(jié)果。檢索GenBank中的基因功能注釋，ybdr基因編碼一個脫氫酶?？赡苡捎陔u白痢沙門氏菌527菌株具有多種該脫氫酶的同工酶的緣故，在 LB液體和 LB平板培養(yǎng)SalΔybdr 527突變株和原始野生株時，未發(fā)現(xiàn)二者具有明顯的生長特性差異。突變株的其他表型鑒定有待進(jìn)一步開展。

圖5 SalΔybdr突變株構(gòu)建原理圖Fig. 5 Construction of the SalΔybdr mutant strain by homologous recombination. A 436 bp fragment of ybdr gene was cloned into pIDM-T, and the resulting IDM mutant SalΔybdr carries a truncated gene followed by linearized plasmid pIDM-T and rest part of the gene.

對eno基因敲除平板篩選到的1個tet抗性菌落，我們用引物eno-I-up分別與m13R-Mdn和m13F-47up引物組合對其進(jìn)行 PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果無任何條帶 (圖6)，對野生菌株菌液的對照PCR擴(kuò)增也無任何產(chǎn)物，因此可初步確定質(zhì)粒沒有特異性地插入eno基因中。進(jìn)一步以該菌培養(yǎng)物的稀釋液為模板，以eno-up和 eno-dn為引物擴(kuò)增eno基因片段，電泳檢測獲得與預(yù)期一致的DNA條帶 (約430 bp，圖略)，測序結(jié)果進(jìn)一步顯示eno基因為野生型，說明eno基因沒有被插入突變。將該菌抽提質(zhì)粒，電泳結(jié)果未檢測到與pIDM-T質(zhì)粒大小相近的小質(zhì)粒 (約3.9 kb，圖略)。由此推測，該克隆可能是質(zhì)粒隨機(jī)重組至細(xì)菌基因組的結(jié)果，具體重組位置有待進(jìn)一步測定。

3 討論

圖6 突變菌株的PCR鑒定Fig. 6 PCR verification of the mutant strains. M: marker (DL5000); 1,2: SalΔybdr mutant strain amplified by ybdr-I-up and m13R-Mdn; 3: SalΔeno mutant strain amplified by eno-I-up and m13R-Mdn; 4: SalΔeno mutant amplification by eno-I-up and m13F-47up; 5: SalΔybdr mutant amplification by ybdr-I-up and m13F-47up; 6,7: wild type control.

Taq DNA聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，在擴(kuò)增DNA的3′末端非模板依賴地加上一個腺苷酸。為解決PCR產(chǎn)物的克隆，需要在線性化載體的3′末端多加一個的脫氧胸腺嘧啶核苷 (T)，這就是TA克隆，相應(yīng)的載體通常被稱為 T-載體[15-16]。商品 T載體多數(shù)是在平末端上加 T而成，而XcmⅠ識別CCA (N5/N4) TGG序列，切割后產(chǎn)生單個核苷酸突出的3￠末端，且切割位點附近的堿基可以簡并[16]。將識別序列的第8位設(shè)為T，重組質(zhì)粒在兩個反向XcmⅠ序列接頭處經(jīng)XcmⅠ切割，便可獲得線性化的T載體。

Knuth等[8]用pIDM1質(zhì)粒構(gòu)建了鼠傷寒沙門氏菌的基因文庫，通過 IDM的方法鑒定了鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028的必需基因，我們采用類似的方法構(gòu)建了雞白痢沙門氏菌 527菌株文庫，并篩選了 527菌株的必需基因 (結(jié)果待發(fā)表)。pIDM1可用于克隆隨機(jī)片段，構(gòu)建文庫，并有效地應(yīng)用于必需基因的大規(guī)模篩選和鑒定，但在實際應(yīng)用時該質(zhì)粒需首先經(jīng) KpnⅠ酶切線性化，然后用熱敏磷酸酶 (Antarctic phosphates)脫磷處理，防止自身環(huán)化[17]，操作繁瑣，成功率低；另一方面它不能直接克隆 PCR產(chǎn)物，因此PCR產(chǎn)物克隆前同樣需要酶切。為方便地克隆PCR產(chǎn)物，提高效率，以用于特定基因的敲除，我們在 pIDM1載體的多克隆位點插入了兩個串聯(lián)XcmⅠ接頭，對pIDM1質(zhì)粒進(jìn)行了T載體改造，經(jīng)檢測正確。構(gòu)建的pIDM-T質(zhì)粒經(jīng)XcmⅠ酶切后即可成為T載體，能直接快速有效地克隆未經(jīng)處理的單個目標(biāo)PCR產(chǎn)物。由于T載體采用內(nèi)切酶法制備，保證了質(zhì)量的穩(wěn)定，且成本低廉，適合普通實驗室使用。

理論上，pIDM-T與 pIDM1質(zhì)粒一樣，在37 ℃培養(yǎng)時不復(fù)制，存在于細(xì)菌中的原始質(zhì)?？截悓㈦S細(xì)菌的分裂而分配給有限的子代細(xì)胞，若質(zhì)粒不與基因組發(fā)生有效的重組，經(jīng)一定代數(shù)后，pIDM-T質(zhì)粒將從新增殖的細(xì)胞中丟失而使細(xì)菌無法在四環(huán)素平板上存活。為驗證上述推論，我們將pIDM-T空質(zhì)粒和pIDM-T_ybdr重組質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)化雞白痢沙門氏菌527菌株，通過觀察兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在 37 ℃ tet平板上的生長情況，我們發(fā)現(xiàn)：pIDM-T空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌在平板上僅形成淡淡的菌苔背景，未見單個重組菌落；而 pIDM-T_ybdr重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌則在較淡的菌苔背景上生長有明顯的重組菌落。由此可見，pIDM-T質(zhì)粒在37 ℃培養(yǎng)時會逐漸丟失，轉(zhuǎn)化菌在四環(huán)素平板上才出現(xiàn)了有限增殖，因此，它不影響IPC值的測定。

為使細(xì)菌總數(shù)和重組菌計數(shù)更加精確和方便，以獲得準(zhǔn)確的IPC值，我們對稀釋方法進(jìn)行了摸索。對30 ℃培養(yǎng)條件下的細(xì)菌總數(shù)計數(shù)，我們曾嘗試 104、105、106、107、108等多個 10倍梯度稀釋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在設(shè)定的 96孔板培養(yǎng)條件下50 μL菌液中的細(xì)菌總數(shù)在2.5×106~2.1×108之間，105和 106倍兩個稀釋梯度較為合適；對37 ℃條件下的重組菌計數(shù)，我們曾嘗試10、20、40、80和160倍 (經(jīng)10倍稀釋后再倍比稀釋)，10、30、90和270倍 (10倍稀釋后再3倍稀釋) 及30、120和480倍 (30倍稀釋后再4倍稀釋) 等多個稀釋梯度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)稀釋倍數(shù)偏低會因為形成菌苔而掩蓋了重組菌落的識別，稀釋過高則平板上無菌落生長，而30和120倍二個梯度較為適合。

與pIDM1質(zhì)粒一樣，pIDM-T可應(yīng)用于特定基因的敲除及必需性的鑒定。為驗證pIDM-T的有效性，我們選取eno和ybdr兩個基因，運(yùn)用插入復(fù)制突變法在雞白痢沙門氏菌527菌株中進(jìn)行了必需性鑒定和敲除。將eno和ybdr擴(kuò)增片段克隆于線性化的pIDM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，經(jīng)鑒定獲得帶有目的片段的重組質(zhì)粒。將攜帶有目的片段的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至527菌株，將轉(zhuǎn)化子增菌后稀釋涂板，并分別置于30 ℃和37 ℃培養(yǎng)，計數(shù)重組子和菌落總數(shù)，根據(jù)公式計算得出eno的IPC值為1.92×10-7，鑒定為必需基因；ybdr的IPC值為1.64×10-4，鑒定為非必需基因。實驗結(jié)果與 DEG必需基因庫 (Database of essential genes)、大腸桿菌 PEC(Profiling of E. coli Chromosome)數(shù)據(jù)庫的已有信息，以及文獻(xiàn)報道[12-13]和本實驗室前期實驗結(jié)果相符。

為確認(rèn)IDM敲除非必需的ybdr基因的插入位點的正確性，以及IDM無法敲除必需基因eno，我們從ybdr基因敲除的篩選平板上隨機(jī)挑取了2個克隆，PCR擴(kuò)增質(zhì)粒插入ybdr基因的交界處片段，并經(jīng)測序證實pIDM-T質(zhì)粒骨架已插入在ybdr基因所在的細(xì)菌基因組特定位點，由此說明，ybdr基因已通過IDM重組被特異性地敲除。ybdr基因是一個脫氫酶編碼基因[18-19]，可能由于雞白痢沙門氏菌527菌株具有多種該脫氫酶的同工酶的緣故，我們未發(fā)現(xiàn)SalΔybdr 527突變株和原始野生株在LB液體和LB平板生長特性的差異。

我們對eno基因敲除篩選平板上生長的唯一1個抗性菌落同樣進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果無任何條帶；進(jìn)一步對該菌落的eno基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測和測序結(jié)果均顯示eno基因為野生型，由此說明eno基因未被pIDM-T質(zhì)粒骨架插入而破壞。對該抗性菌培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，結(jié)果也未檢測到與 pIDM-T質(zhì)粒大小相近的質(zhì)粒，因此我們推測該菌落可能是質(zhì)粒隨機(jī)重組至細(xì)菌基因組的結(jié)果。據(jù)報道，Knuth等[8]應(yīng)用pIDM1質(zhì)粒鑒定鼠傷寒沙門氏菌 257個必需基因時，超過1/3的克隆有非特異性重組現(xiàn)象 (即IPC值大于零)，我們在開展雞白痢沙門氏菌必需基因克隆鑒定時也有類似的現(xiàn)象 (結(jié)果待發(fā)表)，可見這種隨機(jī)重組現(xiàn)象是較普遍的，它可能受基因片段長度等多種因素影響[20]，但因IPC值的數(shù)量級不同，它不影響基因必需性的鑒定。

由此可見，本實驗構(gòu)建的pIDM-T質(zhì)粒是一個有效快速的基因敲除載體，它可以快速克隆PCR產(chǎn)物，并應(yīng)用IDM方法快速有效地鑒定特定基因的必需性，構(gòu)建非必需基因的突變株，為雞白痢沙門氏菌基因功能研究提供了一種有效的手段。

REFERENCES

[1] Tenno T, Goda N, Tateishi Y, et al. Highthroughput construction method for expression vector of peptides for NMR study suited for isotopic labeling. Protein Eng Des Sel, 2004, 17(4): 305?314.

[2] Li JH, Han CQ, Deng J, et al. Construction and functional analysis of a common gene targeting vector with double-selection markers. Chin J Biotech, 2010, 26(12): 1696?1703.李軍華, 韓翠芹, 鄧捷, 等. 雙篩選標(biāo)記打靶載體的構(gòu)建及其功能鑒定. 生物工程學(xué)報, 2010, 26(12): 1696?1703.

[3] Jiang N, Wang YC, Ma ZH, et al. A novel temperature sensitive plasmid-based method for deletion of chromosomal genes. China Biotechol, 2010, 30(3): 85?89.姜娜, 王艷春, 馬志宏, 等. 一種基于溫敏質(zhì)粒的新型基因敲除方法. 中國生物工程雜志, 2010, 30(3): 85?89.

[4] Blaby IK, Phillips G, Blaby-Haas CE, et al. Towards a systems approach in the genetic analysis of Achaea: accelerating mutant construction and phenotypic analysis in Haloferax volcanii. [EB/OL]. [2012-2-25]. http://www.hindawi.com/journals/ arch/2010/426239/.

[5] Baek SH, Rajashekara G, Splitter GA, et al. Denitrification genes regulate Brucella virulence in mice. J Bacteriol, 2004, 186(18): 6025?6031.

[6] Qiao F, Chen ZL, Wang YF, et al. Construction of plasmid pUC19K and its application in Brucella mutant construction. China Biotechnol, 2007, 27(12): 1?5.喬鳳, 陳澤良, 王玉飛, 等. pUC19K質(zhì)粒的構(gòu)建及其在布魯氏菌突變株構(gòu)建中的應(yīng)用. 中國生物工程雜志, 2007, 27(12): 1?5.

[7] Hu Y, Cong YG, Qiu RR, et al. Construction of a bcfD gene knock-out mutant of Salmonella enterica serovar typhi. Biotechnology, 2011, 21(3): 10?13.胡勇, 叢延廣, 邱榮蓉, 等. 傷寒沙門菌 bcfD基因敲除突變株的構(gòu)建. 生物技術(shù), 2011, 21(3): 10?13.

[8] Knuth K, Niesalla H, Hueck C J, et al. Large-scale identification of essential Salmonella genes by trapping lethal insertions. Mol Microbiol, 2004, 51(6): 1729?1744.

[9] Biswas I, Vanger V, Eerlich SD. Efficiency of homologous intermolecular recombination at different locations on the Bacillus subtilis chromosome. J Bacteriol, 1992, 174(17): 5593?5596.

[10] Klumpp J, Fuchs TM. Identification of novel genes in genomic islands that contribute to Salmonella typhimurium replication in macrophages. Microbiology, 2007, 153(4): 1207?1220.

[11] Park HK, Zeng CY. Construction of an Xcm I-generated T vector bearing green fluorescent protein marker for direct cloning of PCR products. Anal Biochem, 2007, 360(1): 144?145.

[12] Cohen R, Yokoi T, Holland JP, et al. Transcription of the constitutively expressed yeast enolase gene ENO1 is mediated by positive and negative cis-acting regulatory sequences. Mol Cell Biol, 1987, 7(8): 2753?2761.

[13] Burnett ME, Liu J, Conway T. Molecular characterization of the Zymomonas mobilis enolase (eno) gene. J Bacteriol, 1992, 174(20): 6548?6553.

[14] Fuchs TM, Klumpp J, Przybilla K. Insertionduplication mutagenesis of Salmonella enterica and related species using a novel thermosensitive vector. Plasmid, 2006, 55(1): 39?49.

[15] Zhou MY, Clark SE, Gomez-Sanchez CE. Universal cloning method by TA strategy. Biotechniques, 1995, 19(1): 34?35.

[16] Jo C, Jo SA. A simple method to construct T-vectors using Xcm I cassettes amplified by nonspecific PCR. Plasmid, 2001, 45(1): 37?40.

[17] Sun CL, Li YW, Wang Y, et al. Construction of a pUC19-T Vector based on Xcm I. J Anhui Agric Sci, 2011, 39(17): 10182?10184.孫程龍, 李業(yè)偉, 王穎, 等. 基于 Xcm I酶切的pUC19-T載體的構(gòu)建. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(17): 10182?10184.

[18] Riley M, Abe T, Arnaud MB, et al. Escherichia coli K-12: a cooperatively developed annotation snapshot-2005. Nucleic Acids Res, 2006, 34(1): 1?9.

[19] Erickson KD, Detweiler CS. The Rcs phosphorelay system is specific to enteric pathogens/commensals and activates ydeI, a gene important for persistent Salmonella infection of mice. Mol Microbiol, 2006, 62(3): 883?894.

[20] Zhou JG, Hong X, Huang CF. Recombineering and its application. Acta Gen Sin, 2003, 30(10): 983?988.周建光, 洪鑫, 黃翠芬. 重組工程及其應(yīng)用. 遺傳學(xué)報, 2003, 30(10): 983?988.