吳云華，楊 帆

(中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢430074)

艾氏劑是持久性有機(jī)污染物(POPs)之一，可引起人肝功能障礙、致癌［1］.通過生物修復(fù)改善持久性有機(jī)污染物的環(huán)境污染是全球環(huán)境保護(hù)的研究熱點(diǎn)［2］.細(xì)胞色素 P450(cytochrome P450，CYP450)是一類依賴于氧氣與NADPH催化內(nèi)源性和外源性化合物代謝的酶.CYP450酶可通過羥基化、環(huán)氧化、脫烷基化和脫鹵化氫等作用催化多種結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)，使許多類型化合物的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化，以解毒或降解POPs［3］.近年來利用CYP450對(duì)污染物進(jìn)行生物降解的研究有很大進(jìn)展__［4］，但對(duì)艾氏劑的生物降解未見報(bào)道.本研究以大腸桿菌為宿主表達(dá)家蠅細(xì)胞色素P450 6A1酶，研究CYP6A1酶及重組大腸桿菌對(duì)艾氏劑的生物降解能力.

1 材料和方法

1.1 材料

CYP450 6A1基因?yàn)楸臼壹蚁壙寺∷?，表達(dá)載體PCW由美國Vanderbilt大學(xué)醫(yī)學(xué)中心提供，載體上含有CPR(人細(xì)胞色素P450還原酶)基因.

限制性內(nèi)切酶Nde I和Hin dⅢ，DNA聚合酶(LA Taq酶)和T4 DNA連接酶(Takara公司);氨芐青霉素(Amp)(上海生工生物工程有限公司);異丙基-β-D-硫代吡喃 半 乳糖苷(IPTG)，δ-氨 基-γ-酮 戊酸(ALA)和二硫蘇糖醇(DTT)(Alfa Aesar公司).

1.2 緩沖液的配制

2 ×TSE Buffer:將34.22g蔗糖和0.0372g EDTA·2Na溶于20mL，1mol/L的 Tris Buffer(pH7.6)過濾除菌.

磷酸緩沖液(spheroplast buffer):將0.1286g乙酸鎂加少許水溶解后加20 mL甘油，1mol/L的K2HPO4和1mol/L的KH2PO4共10 mL，調(diào)pH為7.6，定容至100 mL.

1.3 CYP450 6A1-CPR原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將CYP6A1基因C末端原有SalⅠ酶切位點(diǎn)改為Hin dⅢ酶切位點(diǎn)，同時(shí)用Hin dⅢ單酶切CYP3A4 PCW載體，獲得CPR基因片段(N端含有一段連接片段)，再將CYP6A1基因和CPR基因連接在一起.(見圖1).

圖1 pCW/CYP6A1-CPR載體構(gòu)建流程圖Fig.1 Construction of expression vector pCW/CYP6A1-CPR

CYP6A1 PCR擴(kuò)增所用引物序列為:5'-AGCGACATATGGCTTTTGGTTCATTTCT-3'(上游)，5'-GCCAAGCTTTTATTTAATTTTCTTTCTT-3'(下游).

1.4 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將含有pCW空載體質(zhì)粒和重組表達(dá)質(zhì)粒pCW/CYP6A1和pCW/CYP6A1-CPR的大腸桿菌單菌落接種到5mL LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜.取4mL菌液加至400mL新鮮含 50 ng/L Amp、1 mmol/L VB1和100μL微量元素的TB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)約3h使其OD600值約0.6，加 IPTG 至終濃度為1mmol/L，同時(shí)加入33.6mg ALA，28℃誘導(dǎo)36h［5］.

1.5 膜蛋白的提取

取50mL誘導(dǎo)的培養(yǎng)物，冰上放置30 min.4℃，2800g離心20 min，棄上清收集菌體，用10mL 2×TSE Buffer加等體積冷無菌水重懸.再加10mg溶菌酶，冰上輕搖30 min后，4℃，2800g離心20min，用16mL冰磷酸緩沖液重懸，加16μL DTT，置-70℃凍存過夜.凍存樣品融化后于冰浴中超聲破碎，4mL/次，每破碎5s間隔5s，共8min.取5mL破碎后混合物－80℃保存，其余于4℃，1.2 ×104g離心12min，取上清4℃，1.8 ×105g離心60 min，用4mL磷酸緩沖液重懸沉淀［6］.

1.6 CYP6A1及CPR的活性測(cè)定

CYP6A1含量按Omura和Sato分光光度法測(cè)定.在2個(gè)比色杯中各加2mL P450測(cè)定液，再分別加入20μL待測(cè)樣品和10μL連二亞硫酸鈉，混勻，1min后于紫外分光光度儀上掃描基線，樣品杯中通入CO約1min，穩(wěn)定1min后于400～500 nm內(nèi)掃描，得還原型細(xì)胞色素P450-CO復(fù)合物的吸收光譜圖，記錄A450和A490，按如下公式計(jì)算P450含量:

CPR活性測(cè)定按照Dignam方法［7］改良:分別吸取含0.05mmol/L細(xì)胞色素C的0.1mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)0.98mL、CPR 酶粗液 1 0μL，混勻后測(cè)A550，在樣品池中加入5mmol/L NADPH 10μL，立即混勻后隔15s測(cè)定A5501次，連續(xù)測(cè)定3min.根據(jù)A550差值，按如下公式計(jì)算酶活力:

1.7 膜蛋白對(duì)艾氏劑的催化

根據(jù)CYP6A1及CPR的活性分別對(duì)其進(jìn)行定量，在磷酸緩沖液中分別加入終濃度為50μmol/L CYP450膜蛋白和2，4，20，40μmol/L艾氏劑，再加入1.5mmol/L NADPH起始反應(yīng)，總反應(yīng)體積為0.5mL，37℃水浴15min后加入－20℃預(yù)冷的乙酸乙酯終止反應(yīng)，以七氯作內(nèi)標(biāo)，用酯和正己烷(體積比1∶1)的混合液萃取若干次，蒸干，加入石油醚溶解，做GC-MS分析［8］.色譜條件:DB-5MS毛細(xì)管柱(30m ×0.25mm ×0.25μm)，He 載氣(純度 ＞99.999%)，柱頭壓61.8kPa，載氣恒線速度1.0mL/min，不分流進(jìn)樣1.0μL，進(jìn)樣口溫度 0℃，檢測(cè)器 300℃，氣質(zhì)接口250℃.色譜柱升溫程序:50℃ (保持1min)→50℃(25℃ /min)→150℃(5℃ /min)→250℃ (20℃ /min)→250℃ (保持 5min)［9］.

1.8 轉(zhuǎn)基因大腸桿菌對(duì)艾氏劑的代謝

將活化的菌液按1∶100加至30mL LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至 A600約為0.6，加入艾氏劑使其終濃度為5μmol/L，混勻后按2mL/2h取菌液進(jìn)行萃取，共取8h.用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干萃取樣品后進(jìn)行GC-MS分析.

2 結(jié)果及分析

2.1 載體構(gòu)建

構(gòu)建的CYP450載體用1.3中引物做PCR鑒定，CYP450-CPR載體用NdeⅠ內(nèi)切酶和Hin dⅢ內(nèi)切酶做雙酶切鑒定，見圖2.由圖2可見，CYP6A1基因?yàn)?537bp，CPR基因?yàn)?034bp.2個(gè)載體均為陽性，測(cè)序結(jié)果正確.

圖2 重組質(zhì)粒鑒定圖Fig.2 Identification of recombinant plasmid

2.2 原核蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

原核蛋白電泳結(jié)果見圖3.由圖3可見，2種轉(zhuǎn)基因大腸桿菌表達(dá)的蛋白與對(duì)照組(空載體)蛋白對(duì)比，可明顯看到目的蛋白CYP6A1的表達(dá)，大小為58kDa.CPR蛋白由于表達(dá)量較低，SDS-PAGE無法檢出.

圖3 CYP6A1在不同重組菌表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 Characterization of expression of CYP6A1in different recombinant cells by SDS-PAGE

用CO差異光譜法測(cè)定CYP6A1蛋白含量，結(jié)果見圖4.由圖4可見，400～500nm掃描為最大吸收波長(zhǎng)，ΔACYP6A1-CPR=0.029，ΔACYP6A1=0.024.根據(jù)公式(1)算得表達(dá)的CYP6A1在CYP6A1-CPR和CYP6A1宿主菌的含量分別為68.2nmol/g和50.05 nmol/g.時(shí)間掃描法測(cè)定CPR的酶活力，根據(jù)公式(2)算得8 nmoL/(min·mg).

圖4 重組菌的CYP6A1及CPR表達(dá)量的測(cè)定Fig.4 Determination of the expressed amount of CYP6A1-CPR and CYP6A1 in recombinant E.coli cells

2.3 膜蛋白催化艾氏劑

用3種膜蛋白催化艾氏劑，僅有CYP6A1-CPR蛋白顯示催化艾氏劑氧化的能力，氧化產(chǎn)物為狄氏劑，結(jié)果見圖5.PCW空載宿主菌及CYP6A1宿主菌的膜蛋白與艾氏劑混合后未出現(xiàn)產(chǎn)物，而CYP6A1-CPR宿主菌的膜蛋白與艾氏劑混合后有明顯的產(chǎn)物峰生成，結(jié)果見圖6.

根據(jù)各濃度樣品的狄氏劑產(chǎn)量及剩余的艾氏劑的量，由雙倒數(shù)作圖法可求得CYP6A1的米氏常數(shù)Km=46.1μmol/L.

圖5 CYP6A1－CPR蛋白催化艾氏劑質(zhì)譜分析圖Fig.5 GC-MSprofiles of aldrin catalyzed by CYP6A1-CPR protein

2.4 轉(zhuǎn)基因大腸桿菌對(duì)艾氏劑的代謝

將3種宿主菌活化，于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(A600分別為0.492，0.581，0.630)加入艾氏劑，取樣 1 次/2h，萃取后進(jìn)行GC-MS分析，并根據(jù)狄氏劑產(chǎn)量確定不同宿主菌對(duì)艾氏劑的代謝能力，結(jié)果見圖7.

圖7 不同菌液對(duì)艾氏劑代謝產(chǎn)物狄氏劑的生成量-時(shí)間變化圖Fig.7 Time-amount changes of aldrin metabolites-dieldrin by different recombinant E.coli cells

由圖7可見，CYP6A1宿主菌菌液培養(yǎng)2h未檢測(cè)到到狄氏劑的生成，而4，6，8h后測(cè)得狄氏劑含量分別為1.40，3.50，7.57nmol/L;CYP6A1-CPR 宿主菌菌液培養(yǎng)2，4，6，8h后測(cè)得狄氏劑含量分別為3.39，10.52，127.76nM，163.36nmol/L.說明 PCW空載宿主菌無代謝艾氏劑的活性，CYP6A1宿主菌顯示微弱的代謝活性，因大腸桿菌體內(nèi)存在與CPR蛋白功能類似的遞H+蛋白，而CYP6A1-CPR宿主菌顯示較強(qiáng)的代謝活性.

3 結(jié)語

將家蠅體內(nèi)提取得到的CYP6A1基因轉(zhuǎn)入到大腸桿菌，由大腸桿菌大量表達(dá)CYP6A1蛋白，研究CYP6A1蛋白對(duì)艾氏劑的代謝能力，并在CYP6A1基因后面加入CPR基因，探討CPR蛋白在CYP6A1蛋白對(duì)艾氏劑催化的過程中的作用.結(jié)果表明:CYP6A1蛋白對(duì)艾氏劑有環(huán)氧化作用，CPR蛋白在CYP6A1對(duì)艾氏劑催化的過程中起關(guān)鍵作用，CYP6A1-CPR宿主菌有一定的代謝艾氏劑的能力.

圖6 代謝產(chǎn)物狄氏劑的二次離子質(zhì)譜圖(SIM)Fig.6 Detection ofmetabolism product dieldrin by SIM

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