殷忠平，許艷華，徐 蕓，果 利

(1大慶龍南醫(yī)院，黑龍江大慶163453;2昆明醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院)

頜面部肌肉的調(diào)控和改建在牙頜面畸形矯治及療效保持過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。功能矯治器通過(guò)改變頜面部肌肉功能調(diào)節(jié)和刺激顱面骨骼生長(zhǎng)而促進(jìn)頜的發(fā)育，建立新的神經(jīng)肌肉動(dòng)力平衡協(xié)調(diào)關(guān)系，使口頜系統(tǒng)正常生長(zhǎng)發(fā)育，從而矯正形成中的牙頜面畸形。原代培養(yǎng)骨骼肌細(xì)胞的報(bào)道較多［1～3］，但對(duì)面頜肌細(xì)胞原代培養(yǎng)報(bào)道較少。在借鑒及摸索實(shí)踐的基礎(chǔ)上，本研究用低濃度混合酶改良消化法成功地進(jìn)行了SD大鼠頜面肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)，觀察了該細(xì)胞在體外生長(zhǎng)的一般生物學(xué)特性和生長(zhǎng)規(guī)律，為頜面部肌肉組織功能改建的生物學(xué)和生物力學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 出生2～3 d的SD大鼠(昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科提供)。胎牛血清(FBS:Gibco公司)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，Ⅰ型膠原酶(Sigma公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SD大鼠面頜肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及純化 ①SD大鼠乙醚麻醉，75%乙醇浸泡消毒5 min，解剖分離頜面部咬肌區(qū)肌肉組織。用含100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的冷PBS液沖洗4～6遍，去除脂肪及粘連的軟骨組織，無(wú)菌濾紙拭干，用眼科剪將其剪成約1 mm3的碎塊，冷PBS液洗滌3次，組織漿移入25 mL培養(yǎng)瓶。②先加入0.1%的Ⅰ型膠原酶，消化10 min，棄上清液;再加入混合酶(0.1%的Ⅰ型膠原酶:0.125%的胰酶=1∶1)37℃振蕩消化20 min。待大組織沉淀后，取上清液，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，過(guò)濾。將剩余大組織移入消化培養(yǎng)瓶，按上述步驟重復(fù)2～3次。③濾液1 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀物用含20%FBS的DMEM增殖培養(yǎng)基重懸。細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶，37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中靜置30 min，將上清細(xì)胞懸液如此純化細(xì)胞4次。④ 將純化后的面頜肌成肌細(xì)胞以1×106/mL接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，加增殖培養(yǎng)基，37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中原代培養(yǎng)。

1.2.2 SD大鼠面頜肌細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 當(dāng)原代培養(yǎng)的SD大鼠面頜肌細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶80%以上時(shí)，倒掉培養(yǎng)基，加入0.125%的胰蛋白酶消化2～3 min，并不斷用吸管吹打。用含10%FBS的DMEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞，以1× 105/mL接種于25 mL培養(yǎng)瓶中。首次傳代后的細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底70%～80%后按1∶2或1∶3傳代。

1.2.3 SD大鼠面頜肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及生物學(xué)鑒定 ①倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，記錄細(xì)胞貼壁、分化、融合及肌管形成情況并照相。取第1代培養(yǎng)的SD大鼠面頜肌細(xì)胞蓋玻片爬片，用SP法進(jìn)行結(jié)蛋白(Desmin)免疫組化染色，用成纖維細(xì)胞作對(duì)照。

1.2.4 SD大鼠面頜肌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)繪制及細(xì)胞倍增時(shí)間計(jì)算 ①取第3代SD大鼠面頜肌細(xì)胞，以1.25×104/mL接種至24孔培養(yǎng)板，每天選3孔細(xì)胞用4%苔盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞，每孔計(jì)數(shù)3次，取平均值，共計(jì)數(shù)7 d。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果和時(shí)間繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。②計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間:T=t×log2/ (logNt－logN0)，T為SD大鼠面頜肌細(xì)胞數(shù)增加1倍的時(shí)間，N0為第1天細(xì)胞數(shù)，Nt為生長(zhǎng)高峰期(第5天)細(xì)胞數(shù)，t為倍增時(shí)間(120 h)。

2 結(jié)果

倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的SD大鼠面頜肌細(xì)胞經(jīng)酶消化后呈球形，接種12 h后細(xì)胞開(kāi)始貼壁，單個(gè)，呈圓形或梭形。24 h后細(xì)胞完全貼壁開(kāi)始增生，呈梭形，有兩極，體積小，折光性強(qiáng);少量細(xì)胞多角形，有突起。第2～3天，細(xì)胞具有較強(qiáng)的分裂增殖能力，單核雙極大量伸展，并逐漸變成紡錘形，胞質(zhì)豐富，胞核位于細(xì)胞中央，呈橢圓形，核仁明顯。第4天肌細(xì)胞大量增殖，變得細(xì)長(zhǎng)，呈長(zhǎng)軸平行排列，具有方向性，細(xì)胞之間出現(xiàn)融合現(xiàn)象，形成多核性長(zhǎng)管狀初生肌管，肌管多數(shù)平行排列。第5～6天肌管數(shù)量增多，體積增大，細(xì)胞核數(shù)目明顯增多。第7～8天細(xì)胞融合形成肌管達(dá)高峰，呈典型的“峰～谷”樣生長(zhǎng)。免疫組化染色后顯微鏡下觀察，見(jiàn)肌細(xì)胞呈梭形，胞核較大，細(xì)胞質(zhì)Desmin染色陽(yáng)性(陽(yáng)性率達(dá)95%以上，胞核無(wú)染色)，而成纖維細(xì)胞無(wú)Desmin表達(dá)。證明培養(yǎng)、分化的細(xì)胞為SD大鼠面頜肌細(xì)胞。

SD大鼠面頜肌細(xì)胞接種后經(jīng)過(guò)1 d的潛伏適應(yīng)期，第2天細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，持續(xù)3～4 d;第5天細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)生長(zhǎng)期，第6天細(xì)胞達(dá)到增殖高峰。體外培養(yǎng)2～6 d，細(xì)胞生長(zhǎng)活躍之后增殖速度減慢，數(shù)目逐漸減少。SD大鼠面頜肌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。SD大鼠面頜肌細(xì)胞T平均為37.76 h。

圖1 SD大鼠面頜肌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)

3 討論

胰蛋白酶和膠原酶是酶消化法細(xì)胞培養(yǎng)的常用酶。胰蛋白酶適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，而膠原酶則對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有消化作用［4］。因成肌細(xì)胞位于肌纖維和基底膜之間，單純用膠原酶只能使肌纖維相互分離，只有胰蛋白酶才能分離成肌細(xì)胞，且新生大鼠骨骼肌組織以Ⅰ型膠原為主［5］。本實(shí)驗(yàn)將酶消化步驟略作改進(jìn)，將其分兩步進(jìn)行:先用0.1%的Ⅰ型膠原酶消化分離出肌纖維，10 min后去上清液使易被膠原酶解離出來(lái)的內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等混雜細(xì)胞先游離出來(lái)而被去除，得到純凈的肌纖維;再用0.1%的Ⅰ型膠原酶和0.125%的胰蛋白酶(1∶1)聯(lián)合消化20 min后收集細(xì)胞。結(jié)果表明，低濃度的胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶混合消化，減少了酶對(duì)細(xì)胞的損傷，細(xì)胞培養(yǎng)周期短且細(xì)胞純度高、產(chǎn)量高、活性強(qiáng)、穩(wěn)定性好。此法既節(jié)約了酶的用量，又提高了細(xì)胞成活率，更好地保護(hù)了離體面頜肌細(xì)胞的性狀和生長(zhǎng)代謝，有利于對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行體外研究。

由于成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞30 min左右即可完全貼壁，比肌細(xì)胞貼壁迅速，而此時(shí)肌細(xì)胞因Ca2+作用呈聚集懸浮狀態(tài)，故本實(shí)驗(yàn)利用差速貼壁法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化［6］。每次換瓶前均反復(fù)多次輕輕吹打，使細(xì)胞成單個(gè)分散狀態(tài)，以獲得更高純度的面頜肌細(xì)胞。

可通過(guò)骨骼肌成肌細(xì)胞在體外能夠分化成肌小管、形成橫紋，甚至可見(jiàn)收縮這些特異性形態(tài)學(xué)變化對(duì)其進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)的成肌細(xì)胞，當(dāng)降低血清濃度或細(xì)胞密集時(shí)，清晰可見(jiàn)成肌細(xì)胞在長(zhǎng)軸方向相互融合，形成多核肌管，未見(jiàn)橫紋及成肌細(xì)胞收縮。免疫組織化學(xué)方法鑒定成肌細(xì)胞包括肌球蛋白(Myosin)、Desmin、M-鈣黏蛋白(M-cadherin)及α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-sarcometric actin)［7，8］的檢測(cè)。Desmin具有高度組織特異性［9］，是肌細(xì)胞的骨架蛋白和功能蛋白，在成肌細(xì)胞分化的早期即能檢測(cè)到，是哺乳動(dòng)物成肌細(xì)胞的早期標(biāo)志［10］，也是鑒定成肌細(xì)胞的有效方法。

本實(shí)驗(yàn)先用0.1%的Ⅰ型膠原酶消化解離出肌纖維，再用低濃度的胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶混合酶消化，差速貼壁法純化細(xì)胞的方法步驟簡(jiǎn)單，所需時(shí)間短。為從細(xì)胞生物學(xué)角度研究外因作用下頜面部肌肉組織適應(yīng)性功能改建機(jī)制提供了細(xì)胞體外培養(yǎng)的模型。

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