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血液凝固分析儀檢測(cè)原理和質(zhì)量控制管理的研究

2012-02-01 04:10劉建新袁衛(wèi)英馮璐瓊邢家偉
中國(guó)醫(yī)學(xué)裝備 2012年5期
關(guān)鍵詞:鋼珠磁珠血凝

劉建新 蘇 磊 袁衛(wèi)英 馮璐瓊 王 博 邢家偉

在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中,檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了單純輔助臨床診斷的認(rèn)識(shí)范圍。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展,臨床檢驗(yàn)的范圍日益廣泛,檢驗(yàn)的項(xiàng)目越來(lái)越多。在血栓或止血實(shí)驗(yàn)室中最基本的設(shè)備就是血液凝固分析儀。利用血凝儀進(jìn)行血栓與止血的實(shí)驗(yàn)室檢查,可為出血性和血栓性疾病的診斷、溶栓和抗凝治療的監(jiān)測(cè)及療效觀察提供有價(jià)值的指標(biāo)。血栓與止血的檢測(cè)已從傳統(tǒng)的手工方法發(fā)展到應(yīng)用全自動(dòng)血凝儀,從單一的凝固法發(fā)展到免疫法和生物化學(xué)法,血栓與止血的檢測(cè)也因此變得簡(jiǎn)便、迅速、準(zhǔn)確、可靠。目前,自動(dòng)血凝分析儀已經(jīng)從第一代單純使用終點(diǎn)法的半自動(dòng)單通道血凝分析儀、第二代使用多通道和多種測(cè)定原理與方法的半自動(dòng) 血凝分析儀,發(fā)展到第三代全自動(dòng)血凝儀,可迅速定量分析與凝血、抗凝及纖溶有關(guān)的多種因子。

凝血時(shí)間是指血液自血管抽出放入試管中,從液態(tài)的溶膠狀態(tài)變?yōu)榘牍腆w凝膠狀態(tài)所需要的時(shí)間。為了避免手術(shù)中出血,在患者手術(shù)前要進(jìn)行血液凝固項(xiàng)目的檢測(cè)。由于影響止血的因素很多,因此以往常規(guī)中用出血時(shí)間和凝血時(shí)間作為診斷指標(biāo),其結(jié)果異常時(shí)再進(jìn)一步做較復(fù)雜的試驗(yàn)尋找病因。此外,凝血時(shí)間可作為某些疾病的篩查依據(jù)[1]。

1 血液凝固分析儀的檢測(cè)原理

目前開(kāi)展的血栓或止血成分檢測(cè)方法,主要方法有凝固法、底物顯色法、免疫法等。凝固法是血凝分析儀和血栓或止血實(shí)驗(yàn)中最基本、最常用的方法。

2.1 凝固法及其分類[2-3]

凝固法按測(cè)量原理可分為電流法、光學(xué)法和磁珠法3類。由于光學(xué)法幾乎可涵蓋各種檢測(cè)方法,為了降低儀器制造成本,全自動(dòng)血凝儀以光學(xué)法居多。凝固法是通過(guò)檢測(cè)血漿在凝血激活劑作用下的一系列物理量(光、電、機(jī)械運(yùn)動(dòng)等)的變化,再由數(shù)模轉(zhuǎn)換分析得到最終結(jié)果,所以也可將其稱作生物物理法。

2.1.1 電流法

電流法利用纖維蛋白原無(wú)導(dǎo)電性而纖維蛋白具有導(dǎo)電性的特點(diǎn),將待測(cè)樣品作為電路的一部分,根據(jù)凝血過(guò)程中電路電流的變化來(lái)判斷纖維蛋白的形成。

2.1.2 光學(xué)法

光學(xué)法血凝儀是根據(jù)凝固過(guò)程中濁度的變化來(lái)測(cè)定凝血功能的。根據(jù)儀器不同的光學(xué)測(cè)量原理,又可分為散射比濁法和透射比濁法兩類(如圖1所示)。

圖1 散射或透射比濁法原理圖

(1)散射比濁法:散射比濁法是根據(jù)待驗(yàn)樣品在凝固過(guò)程中散射光的變化來(lái)確定檢測(cè)終點(diǎn)的。

(2)透射比濁法:透射比濁法是根據(jù)待測(cè)樣品在凝固過(guò)程中吸光度的變化來(lái)確定凝固終點(diǎn)的。

2.1.3 雙磁路磁珠法

測(cè)試杯的兩側(cè)各有一組驅(qū)動(dòng)線圈,它們產(chǎn)生恒定的交替電磁場(chǎng),使測(cè)試杯內(nèi)特制的去磁小鋼珠保持等幅振蕩運(yùn)動(dòng)。凝血激活劑加入后,隨著纖維蛋白的產(chǎn)生增多,血漿的粘稠度增加,小鋼珠的運(yùn)動(dòng)振幅逐漸減弱,儀器根據(jù)另一組測(cè)量線圈感應(yīng)到小鋼珠運(yùn)動(dòng)的變化,將運(yùn)動(dòng)幅度衰減到50%時(shí)確定為凝固終點(diǎn)。

2.2 底物顯色法及其原理[4-7]

底物顯色法是通過(guò)測(cè)定產(chǎn)色底物的吸光度變化來(lái)推測(cè)所測(cè)物質(zhì)的含量和活性的,該方法又可稱為生物化學(xué)法。

血凝儀使用產(chǎn)色底物檢測(cè)血栓與止血指標(biāo)的原理:通過(guò)人工合成具有某種特定作用位點(diǎn)的小段肽,將可水解產(chǎn)生物的化學(xué)基團(tuán)與作用位點(diǎn)的氨基酸相連。測(cè)定時(shí)由于凝血因子具有蛋白水解酶的活性,它不僅能作用于天然蛋白質(zhì)肽鏈,也能作用于人工合成的肽段底物,從而釋放出產(chǎn)色基團(tuán),使溶液呈色。產(chǎn)生顏色的深淺與凝血因子活性呈比例關(guān)系,故可進(jìn)行精確的定量。目前人工合成的多肽底物有數(shù)十種,而最常用的是對(duì)硝基苯胺(PNA),呈黃色,可用405 nm波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。底物顯色法特異性及精密度較高,而且易于自動(dòng)化,為血栓或止血檢測(cè)開(kāi)辟了新途徑。

2.3 免疫學(xué)方法及其原理[5]

在免疫學(xué)方法中以純化的被檢物質(zhì)為抗原,制備相應(yīng)的抗體,然后利用抗原抗體反應(yīng)對(duì)被檢物質(zhì)進(jìn)行定性或定量測(cè)定。

(1)免疫擴(kuò)散法:將被測(cè)物與相應(yīng)抗體在一定的介質(zhì)中結(jié)合,測(cè)定其沉淀環(huán)的大小,與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較,計(jì)算待測(cè)物的濃度。此方法適合含量較高的凝血因子的檢測(cè)。

(2)“火箭”電泳:在一定電場(chǎng)中,凝膠支持物內(nèi)的被檢物與其相對(duì)應(yīng)抗體結(jié)合形成“火箭”峰,“火箭”峰的高度與其含量成正比,通過(guò)測(cè)定峰高并與標(biāo)準(zhǔn)值比較而進(jìn)行定量測(cè)定。此方法操作復(fù)雜,臨床應(yīng)用較少。

(3)雙向免疫電泳:通過(guò)水平與垂直兩個(gè)方向進(jìn)行電泳可將某些分子結(jié)構(gòu)異常的凝血因子進(jìn)行分離。

(4)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法):用酶標(biāo)抗原或抗體和被檢物進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng),經(jīng)過(guò)洗滌除去未結(jié)合的抗原或抗體及標(biāo)本中的干擾物質(zhì),留下固定在管壁的抗原抗體復(fù)合物,然后加入酶的底物和色原性物質(zhì),經(jīng)過(guò)反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì),用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定,顏色的深淺與被檢物濃度水平成比例關(guān)系。該方法特異性及敏感度較高,目前已用于許多止血、血栓成分的檢測(cè)。

(5)免疫比濁法:將被檢物質(zhì)與相應(yīng)的抗體混合形成復(fù)合物,產(chǎn)生足夠大的沉淀顆粒,通過(guò)透射比濁或散射比濁進(jìn)行測(cè)定。此方法操作簡(jiǎn)便,準(zhǔn)確性好,便于自動(dòng)化。免疫比濁法可分為直接濁度法分析和乳膠比濁法分析。乳膠比濁法分析是將欲待檢物質(zhì)相對(duì)應(yīng)的抗體包被在直徑為15~60 nm的乳膠顆粒上,然后與被檢物結(jié)合,形成抗原抗體復(fù)合物的乳膠顆粒凝集,體積增大,使透射光和散射光的變化更為顯著,從而提高試驗(yàn)的靈敏度。

2.4 幾種檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)

用電流法來(lái)判斷凝固終點(diǎn)不可靠且單一,所以這種方法很快被更靈敏、更易擴(kuò)展的光學(xué)法所代替。

(1)散射比濁法測(cè)定時(shí),當(dāng)測(cè)定含有干擾物(高脂血癥、黃疸和溶血)或底纖維蛋白原血癥的特殊樣本時(shí),由于本底濁度的存在,其作為起始點(diǎn)0%的基線會(huì)隨之上移或下移,儀器在數(shù)據(jù)處理過(guò)程中用本底扣除的方法來(lái)減少這類標(biāo)本對(duì)測(cè)定的影響。以犧牲有效信號(hào)的動(dòng)態(tài)范圍為代價(jià),對(duì)于高濁度標(biāo)本并不完全有效。就濁度測(cè)量原理而言,散射比濁法更為合理、準(zhǔn)確。這類儀器的光源、樣品、接收器成直角排列,接收器得到完全濁度測(cè)量所需的散射光。而在透射比濁法中,光源、樣品、接收器呈一直線排列,接收器得到的則是很強(qiáng)的透射光和較弱的散射光,前者是有效成分,后者應(yīng)扣除,因此要進(jìn)行信號(hào)校正,并按經(jīng)驗(yàn)公式換算散射濁度。此法儀器簡(jiǎn)單,但精度較差。

(2)光學(xué)法凝血測(cè)試的優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高、儀器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于自動(dòng)化,缺點(diǎn)是樣品的光學(xué)異常、測(cè)試杯的光潔度、加樣中的氣泡等都會(huì)成為測(cè)量的干擾因素。光學(xué)法血凝儀的最大缺點(diǎn)是遇到有較高初始濁度的樣品就無(wú)能為力,為了克服樣品的干擾,不同型號(hào)的光學(xué)法血凝儀中采取了各種不同的措施。有的用本底扣除的百分濁度法,這對(duì)中、低初始濁度的樣品有補(bǔ)償作用,但不能解決高濁度樣品的測(cè)試;有的利用一階微分的峰值作為凝固終點(diǎn),但微分處理會(huì)引起重復(fù)性變差。

(3)雙磁路磁珠法進(jìn)行凝血測(cè)試,完全不受溶血、黃疸及高脂血癥的影響,即使加樣中產(chǎn)生氣泡也不會(huì)影響測(cè)試結(jié)果。磁珠法的試劑用量只為光學(xué)法的一半,因?yàn)樵诒葷釡y(cè)量過(guò)程中,激發(fā)光束必須照在測(cè)試杯的中間,所以要有足夠的試劑量。而在雙磁路磁珠法測(cè)量中,鋼珠在測(cè)試杯的底部運(yùn)動(dòng),因此試劑只要覆蓋鋼珠運(yùn)動(dòng)即可。雙磁路磁珠法中的測(cè)試杯和鋼珠都是專利技術(shù),有特殊要求。測(cè)試杯底部的弧線設(shè)計(jì)與磁路相關(guān),直接影響測(cè)試靈敏度。小鋼珠經(jīng)過(guò)多道工藝特殊處理,完全去掉磁性。在使用過(guò)程中,加珠器應(yīng)遠(yuǎn)離磁場(chǎng),避免鋼珠磁化。為保證測(cè)量的正確性,鋼珠應(yīng)當(dāng)一次性使用。使用磁珠法進(jìn)行測(cè)量成本較光學(xué)法大。

此外,磁珠法在測(cè)定時(shí)具有一定的局限性:①必須有明顯和牢固的凝塊形成才能作出判斷;②弱凝固反應(yīng)對(duì)結(jié)果判斷有干擾;③受到外界磁場(chǎng)的影響;④受到血漿黏度的影響;⑤受到很多物理因素的影響;⑥不能開(kāi)展發(fā)色底物和免疫法檢測(cè)。

3 血液凝固分析儀的質(zhì)量控制[8-9]

凝血功能檢測(cè)大部分是基于測(cè)定纖維蛋白形成時(shí)間來(lái)判斷終點(diǎn)的,因此干擾因素較多,為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性以及將結(jié)果誤差控制在允許的范圍內(nèi),就必須建立一套完整的質(zhì)量控制體系。全程的質(zhì)量控制體系應(yīng)包括正確的標(biāo)本采集、適用的實(shí)驗(yàn)方法、穩(wěn)定可靠的試劑和標(biāo)準(zhǔn)品、日常的設(shè)備維護(hù)等一套程序。

(1)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該對(duì)標(biāo)本采集的注意事項(xiàng)進(jìn)行詳細(xì)的規(guī)定。止血、凝血系統(tǒng)由一系列的酶和酶原組成,易被激活或變性,因此標(biāo)本必須按照規(guī)定的方法采集,以保存凝血因子的全部特性。

(2)實(shí)驗(yàn)室需要建立對(duì)檢測(cè)試劑的評(píng)價(jià)方法。目前,檢驗(yàn)科使用的多為商品化的檢測(cè)試劑,因各廠家試劑的敏感指數(shù)不同,導(dǎo)致結(jié)果也不盡相同,因此選擇檢測(cè)試劑因掌握以下原則:①在使用商品試劑時(shí)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行操作,并對(duì)試劑進(jìn)行重復(fù)性和敏感性測(cè)試;②按照實(shí)驗(yàn)室要求選擇最佳試劑,如有儀器配套試劑應(yīng)優(yōu)先選擇,以保證檢測(cè)結(jié)果的溯源性。

(3)實(shí)驗(yàn)室還要建立儀器校準(zhǔn)程序及室內(nèi)質(zhì)控程序。按照儀器廠家產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)對(duì)儀器的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行校準(zhǔn),保證儀器處于正常的工作狀態(tài),定期使用指定的多水平校準(zhǔn)品對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn),并建立相應(yīng)的溯源程序。同時(shí)選擇多水平質(zhì)控品,采用滿足要求的質(zhì)控規(guī)則進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控,并對(duì)室內(nèi)質(zhì)控進(jìn)行周期性評(píng)價(jià),保證儀器檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。對(duì)使用不同檢測(cè)原理的儀器應(yīng)建立相應(yīng)的參考值,并每日核查和記錄溫育的溫度。

(4)實(shí)驗(yàn)室需有檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)準(zhǔn)則。同一物質(zhì)使用不同的檢測(cè)方法,其結(jié)果也往往不同,因此需對(duì)不同的檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證選取最佳檢測(cè)方法。

(5)實(shí)驗(yàn)室需參加室間質(zhì)控程序,通過(guò)室間質(zhì)控可進(jìn)一步保證每個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)語(yǔ)

血液凝固分析儀是一個(gè)復(fù)雜的整體,其各個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果,因此適用的檢測(cè)原理及全程的質(zhì)量控制體系將保證測(cè)試項(xiàng)目結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

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