劉海林，張子彥，郭云云，李景春，宋永斌，徐江濤

（蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院神經內科，烏魯木齊 830000）

睡眠呼吸暫停綜合征（sleep apnea syndrome，SAS）的病理生理機制本質上是一個慢性間斷性缺氧伴二氧化碳潴留（chronic intermittent hypoxia with carbon dioxide retention，CIH-CR）的過程。大量的研究表明，SAS是多種疾病的獨立危險因素，可導致心、肺、腎、腦及血液等器官或系統(tǒng)損害［2］。建立理想的SAS動物模型對研究其發(fā)病機制及治療有重要意義。本研究旨在建立一種成本低廉、操作簡便、易于推廣、符合SAS病理生理學特征CIH-CR的動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級健康雄性昆明種小白鼠，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，動物合格證［SCXK（新）2003-0001］，體重18～22g，共22只。分為常氧（normal control，NC）及CIH-CR組，每組11只。

1.2 實驗儀器

自制實驗倉（包括：有機玻璃、繼電器、微動電極、牽引器、不銹鋼套管）；CY212C型測氧儀（浙江電化分析儀器廠），EM-21型便攜式二氧化碳檢測儀（連云港金升科技有限公司），PC-68B血氧飽和度儀（深圳市科瑞康實業(yè)有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 CIH-CR實驗倉及其工作原理：本實驗倉規(guī)格為45.3×22.0×4.9 cm。倉底部有通氣孔并與打好孔的不銹鋼套管相連，通過兩個牽引器控制通氣孔的開啟與關閉，關閉（缺氧處理）與開啟（復氧處理）時間由兩個繼電器控制，開啟與關閉時間可依實驗需要調整，達到給予小鼠反復缺氧/復氧自動循環(huán)的目的。二氧化碳檢測儀固定于倉內，實驗倉頂端預留測氧孔。實驗期間小鼠活動自如，自由飲食。

實驗倉工作原理：關閉實驗倉時，小鼠呼吸倉內有限的O2排出CO2造成低O2和CO2潴留，然后使實驗倉與外界相通形成復氧，O2和CO2濃度迅速恢復正常水平。循環(huán)時間由繼電器自動控制，每次循環(huán)150s，其中關閉時間為120s，開啟時間為30 s，每天8 h（10∶00～18∶00），其余時間置小鼠飼養(yǎng)籠，室溫、空氣、正常飲食。NC組每日同時置相同規(guī)格有機玻璃箱內，箱內開放，不形成缺O(jiān)2和CO2潴留。間斷性缺氧實驗過程中箱內氣體濃度由二氧化碳檢測儀和測氧儀監(jiān)測。

為了驗證實驗倉的效果，測定10只小鼠在此間斷缺氧條件下尾部末端SO2變化情況，方法為：先將小鼠用苯巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，放入實驗倉中，尾部通過預留孔伸出倉外，使用血氧飽和度儀測尾部末梢SO2。

1.3.2 右室肥厚指數(shù)計算：實驗小鼠腹腔內注射戊巴比妥鈉30 mg/kg體重，直接開胸切取心臟，在房室瓣水平去除心房、大血管和心包組織，沿室間隔分離左心室（包括室間隔）和右心室，冰鹽水沖洗干凈，清潔濾紙吸干水份后稱左心室（含室間隔）濕重和右心室濕重，計算右心室濕重/左心室（含室間隔）濕重（RV/LV+S），即為右心室心肌肥厚指數(shù)［3］。

1.3.3 病理觀察：實驗終點取小鼠心、肺、腎、腦組織以10％的甲醛固定、石蠟切片、常規(guī)HE染色，光鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理，采用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 實驗結果

2.1 CIH-CR實驗倉內O2濃度、CO2濃度和小鼠尾部末端SO2周期性變化動態(tài)測定結果

實驗倉內 O2濃度、CO2濃度和小鼠尾部末端SO2見表1及圖1，圖2，圖3。

表1 10個循環(huán)周期中缺氧箱內各個時間點O2濃度（％）、CO2濃度（‰）及小鼠尾部末端SO2（％）Tab.1 The concentration of O2，CO2 and the SO2 in the empennage ofmouse in the cabin in 10 cycle

圖1 箱內O2濃度變化趨勢Fig.1 The change trend of O2 concentration in the cabin

圖2 箱內CO2濃度變化趨勢Fig.2 The change trend of CO2 concentration in the cabin

圖3 小鼠尾部末端血SO2變化趨勢Fig.3 The change trend of the SO2 in the empennage ofmouse in the cabin

2.2 CIH-CR組小鼠右室肥厚指數(shù)的影響

NC組和CIH-CR組小鼠右室肥厚指數(shù)分別為0.21±0.03和0.30±0.02，與NC組相比，CIH-CR組小鼠右心肥厚指數(shù)明顯升高（P＜0.01）。

2.3 心、肺、腎和腦組織HE染色結果

2.3.1 小鼠心肌組織病理學改變：NC組小鼠心肌組織結構正常，肌纖維排列規(guī)則，間質無明顯水腫。CIH-CR組小鼠心肌細胞可見核腫脹，間質水腫，偶見輕度嗜酸性變，見封3圖4～5。

2.3.2 小鼠心組織病理學改變：NC組組胞壁薄，血管壁較光滑，與對照組比較，CIH-CR組小鼠肺泡腔體積變小，血管擴張充血，肺間質增多，肺泡間質毛細血管增多，見封3圖6～7。

2.3.3 小鼠腎臟組織病理學改變：NC組腎小球、腎小管細胞及上皮細胞排列整齊，胞漿均勻；CIH-CR組腎小球腎小管上皮腫脹，管腔消失，部分腎小管內有蛋白管型，見封3圖8～9。

2.3.4 小鼠腦組織病理學改變：NC組神經元 大小、形態(tài)正常；CIH-CR組性神經元明顯增加，細胞腫脹突出，胞漿空泡增大，細胞皺縮，胞體深染，見封3圖10～11。

3 討論

目前，在已發(fā)表的SAS動物模型中，不同的實驗缺氧-復氧循環(huán)時間30～300 s不等，每天總缺氧時間5～8 h不等，缺氧累計天數(shù)14～70 d不等，最低O2濃度3％ ～10％不等。對二氧化碳是否潴留觀點不一［4-8］，不同研究者的實驗方案重復性和可比性較差。造成低氧的方式主要是向缺氧裝置中沖入氮氣或壓縮空氣與混合氣體［7，9］，可以對缺氧時間及程度精確控制，但儀器成本較高，不利于推廣。

本實驗采用小鼠作為 CIH-CR模型的實驗動物，根據(jù)小鼠晝伏夜出的習性，每天間斷缺氧在日間進行（10∶00～18∶00）。在間斷缺氧箱密閉后，由于小鼠呼吸箱內有限O2，排出CO2，箱內O2濃度逐漸降至 10％ ±1.3％，CO2濃度逐漸升至979.7±39.8％。給予通氣后箱內 O2濃度在120 s左右迅速升高至 20％ ±0.9％，CO2濃度降至343.6±12.8％。同時檢測血氧飽和度發(fā)現(xiàn)，缺氧最低點時 SO2為71.2±2.1％，當恢復至正常氧濃度時SO2為93.5±2.2％，類似于SAS患者血氧濃度變化曲線，說明該模型能模擬SAS的血氧特點。本實驗結果顯示，4周后模型組小鼠右心室明顯肥大（P＜0.01），提示4周的 CIH-CR循環(huán)可模擬 SAS。并且組織病理學表現(xiàn)符合低氧后改變，進一步從形態(tài)學角度說明本研究制備了可靠的SAS小鼠模型。

我們的實驗是通過小鼠的自主呼吸耗竭O2，產生CO2，符合SAS逐漸缺氧和高CO2的生理過程。本實驗箱通過電控閥控制箱的開啟和閉合，可調節(jié)缺氧時間，從而可根據(jù)需要制作不同程度的SAS模型。實驗箱在電極轉換調控閥門時產生一定的聲音，不斷干擾小鼠的睡眠，符合SAS對睡眠結構產生影響的過程。箱內剛好容納22只小鼠，此空間小鼠耐受良好，便于觀察小鼠呼吸及自主運動情況，且可以成批復制小動物模型。本模型設計簡單，成本低廉，易于推廣。

總之，雖該實驗箱存在一些缺點，但因其符合SAS病理過程，設計簡單，成本低廉，不失為一種理想的SAS模型實驗箱。

［1］郭彥紅，姬秋和，張丙芳.阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征與IL -6關系的研究［J］.西北國防醫(yī)學雜志，2002，23（1）：21 -22.

［2］李景春，徐江濤.睡眠呼吸暫停綜合征嚙齒動物模型的研究進展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2009，9（12）：2377-2379.

［3］Nattie EE，Doble EA.Threshold of intermittent hypoxia-induced right ventricular hypertrophy in the rat［J］.Respir Physiol.1984，56（2）：253-259.

［4］Fletcher EC，Lesske J，Qian W，et al.Repetitive，episodic hypoxia causes diurnal elevation of blood pressure in rats［J］.Hypertension，1992，19（6Pt1）：555-561.

［5］Fagan KA.Selected Contribution：Pulmonary hypertension in mice following intermittent hypoxia［J］.JAppl Physiol，2001，90 （6）：2502-2507.

［6］Park AM，Suzuki YJ.Effects of intermittent hypoxia on oxidative stress-induced myocardial damage in mice［J］.J Appl Physiol.2007，102（5）：1806-1814.

［7］McGuire M，MacDermott M，Bradford A.The effects of chronic episodic hypercapnic hypoxia on rat upper airway muscle contractile properties and fiber-type distribution［J］.Chest.2002，122（4）：1400-1406.

［8］XU W，Chi L，ROW BW，et al.Increased oxidative stress is associated with chronic intermittent hypoxia-mediated brain cortical neuronal cell apoptosis in a mouse model of sleep apnea［J］.Neuroscience，2004，126（2）：313-323.

［9］Troncoso Brindeiro CM，da Silva AQ，A llahdadi KJ，et al.Reactive oxygen species contribute to sleep apnea-induced hypertension in rats［J］.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2007，293（5）：2971-2976.