盧 斌，顧 萍，邵加慶，杜 宏，王 堅(jiān)

（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院內(nèi)分泌科，南京 210002）

骨骼肌胰島素抵抗是肥胖和2型糖尿病發(fā)生的 重要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）負(fù)性調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其表達(dá)增加及活性增強(qiáng)可以導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。吡格列酮作為胰島素增敏劑改善胰島素抵抗，但其作用機(jī)制尚未明確。本研究通過(guò)吡格列酮干預(yù)來(lái)觀察其對(duì)db/db小鼠骨骼肌PTP1B表達(dá)的影響，探討吡格列酮改善胰島素敏感性的可能作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：

C57BL/KsJ db/db小鼠購(gòu)自美國(guó) Jackson實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并在本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁育成功（SCXK［軍］20072012）。實(shí)驗(yàn)期間小鼠在層流柜中飼養(yǎng)，所有器具及食物均消毒，無(wú)菌操作。小鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水，保持墊料干燥，溫度保持在23℃，12 h/12 h亮暗周期。按隨機(jī)數(shù)字表將小鼠分為吡格列酮組10只和db/db對(duì)照組10只，每日固定時(shí)間分別給予吡格列酮（艾汀，北京太洋藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）10 mg/kg體重和相同體積的安慰劑（5％阿拉伯膠）灌胃，連續(xù)給藥4周，另選取10只同周齡同窩出生的C57BL/KsJ db/m小鼠給予安慰劑灌胃作為非糖尿病對(duì)照組（db/m組）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，所有動(dòng)物麻醉處死取骨骼肌，凍存于-70℃。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 生理生化指標(biāo) 每周監(jiān)測(cè)小鼠體重和空腹血糖，投藥前和投藥4周后測(cè)定空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS）。血糖測(cè)定使用強(qiáng)生公司生產(chǎn)的One-Touch血糖儀。血清胰島素水平的測(cè)定采用小鼠胰島素 ELISA試劑盒（Morinaga，Yokohama， Japan）。胰島素敏感性用 HOMA胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR，HOMA-IR=FPG×FINS/22.5）來(lái)評(píng)價(jià)。1.2.2 PTP1B蛋白表達(dá)的測(cè)定 提取骨骼肌蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，取50 ug蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉后加入羊抗鼠PTP1B多克隆抗體（Santa Cruz公司）過(guò)夜孵育，洗膜后加入生物素標(biāo)記的兔抗羊 IgG抗體（Santa Cruz公司）孵育2 h，洗膜后用 ECL增強(qiáng)顯色。同時(shí)用同樣方法對(duì)上述樣品用抗鼠的β-actin單克隆抗體免疫雜交與顯色作為內(nèi)參對(duì)照。用BioRad Flour-S成像儀將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 生理生化指標(biāo)

4周齡db/db小鼠進(jìn)入試驗(yàn)時(shí)已表現(xiàn)為肥胖，血糖升高，高胰島素水平，與 db/m組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而吡格列酮組與db/db對(duì)照組小鼠上述指標(biāo)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。吡格列酮組小鼠在給予藥物干預(yù) 4周后FBG、FINS水平及 HOMA-IR均顯著低于 db/db對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 3組小鼠的體重及生理、代謝指標(biāo)比較Tab.1 The comparison of weight，physiological and metabolic parameters

2.2 Westernblot檢測(cè)PTP1B蛋白表達(dá)

應(yīng)用WB檢測(cè)各組小鼠骨骼肌PTP1B蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，db/db組小鼠骨骼肌 PTP1B表達(dá)顯著高于db/m組（P＜0.05），給予吡格列酮干預(yù)4周后，吡格列酮組db/db小鼠骨骼肌PTP1B表達(dá)水平較 db/db對(duì)照組顯著降低（P ＜0.05）（圖1）。

3 討論

db/db小鼠是一種先天肥胖性2型糖尿病小鼠模型，由于瘦素受體基因發(fā)生突變所致。一般于出生后3～4周即可表現(xiàn)為肥胖，血糖升高，胰島素抵抗等特性，是研究2型糖尿病的理想模型。本研究中4周齡db/db小鼠表現(xiàn)為高血糖、體重增加，胰島素抵抗指數(shù)增加，與對(duì)照組相比有顯著性差異。

圖1 圖1 各組小鼠骨骼肌PTP1B蛋白表達(dá)量Fig.1 PTP1B protein expression in muscle of each group

肥胖、胰島素抵抗的機(jī)制目前尚未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到正負(fù)調(diào)節(jié)蛋白的協(xié)同作用，而在眾多負(fù)調(diào)節(jié)因子中PTP1B作用突出。PTP1B是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的一員，在人體多種組織細(xì)胞中普遍存在，主要位于胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，它通過(guò)使激活的胰島素受體及胰島素受體底物等去磷酸化失活而發(fā)揮生理功能［1］。研究發(fā)現(xiàn)PTP1B的表達(dá)水平在糖尿病或發(fā)生胰島素抵抗時(shí)明顯升高。在嚙齒類糖尿病動(dòng)物的骨骼肌和脂肪細(xì)胞中，PTP1B的表達(dá)和活性均顯著升高［2］。PTP1B基因敲除小鼠，與野生型小鼠相比，其胰島素敏感性增強(qiáng)，肝臟及肌肉組織中的胰島素受體磷酸化水平升高，該小鼠即使在致肥胖飲食條件下也不出現(xiàn)肥胖或胰島素抵抗［3］。這些研究提示PTP1B是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)性調(diào)節(jié)者，PTP1B也就成為胰島素抵抗機(jī)制研究的重要位點(diǎn)［4］。

吡格列酮屬于噻唑烷二酮類藥物（thiazolidilsdioms，TZDs），作為胰島素增敏劑，能有效降低2型糖尿病患者血糖和血漿胰島素水平，提示該藥不刺激胰島素的分泌，而是通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性達(dá)到降低血糖的效果。目前認(rèn)為其主要作用機(jī)制是通過(guò)激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferator-activated receptor -γ，PPARγ），調(diào)節(jié)某些參與葡萄糖和脂肪酸代謝的胰島素反應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)錄［5］。吡格列酮如何改善骨骼肌胰島素敏感性具體機(jī)制目前還不確切，本研究對(duì)此進(jìn)行初步探討。PPARγ在骨骼肌表達(dá)量很低，只有脂肪組織表達(dá)量的10％［6］，因此以往認(rèn)為脂肪組織是吡格列酮的主要作用位點(diǎn)，而骨骼肌胰島素作用改善是由于下調(diào)脂質(zhì)水平及減少葡萄糖脂肪循環(huán)引起的。然而骨骼肌胰島素敏感性改善非常明顯，而且TZD類藥物可以在成熟的骨骼肌細(xì)胞L6增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)［7］。TZD類藥物是否通過(guò)PPAR非依賴途徑增加肌肉胰島素敏感性?

本研究用db/db糖尿病小鼠模型，觀察吡格列酮對(duì)其骨骼肌中PTP1B表達(dá)的影響，探討吡格列酮改善骨骼肌胰島素抵抗的分子機(jī)制。由于PTP1B是一種胞內(nèi)蛋白，目前還沒(méi)有定量檢測(cè)的方法，所以我們采用Western blot進(jìn)行半定量蛋白檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，db/db小鼠骨骼肌PTP1B蛋白表達(dá)明顯增加。經(jīng)吡格列酮處理4周后db/db小鼠血糖下降，胰島素抵抗明顯改善，同時(shí)伴隨著骨骼肌PTP1B水平的下降。這提示PTP1B可能與吡格列酮改善骨骼肌胰島素敏感性有關(guān)。因此吡格列酮可能是通過(guò)減少PTP1B表達(dá)從而增加骨骼肌胰島素敏感性。但仍需大量進(jìn)一步體外研究來(lái)證實(shí)該作用。下一步通過(guò)體外試驗(yàn)研究吡格列酮對(duì)骨骼肌細(xì)胞PTP1B表達(dá)的影響及應(yīng)用PTP1B激動(dòng)劑或抑制劑進(jìn)行干預(yù)，這有助于研究PTP1B在胰島素抵抗中的作用及吡格列酮作用機(jī)制。

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