石桂英，陳顯達(dá)，陳陟陽，馬小茗，鞠振宇

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

端粒（telomere）是真核細(xì)胞染色體末端的特殊核蛋白復(fù)合體，其包括一段非編碼的TTAGGG重復(fù)序列和與之相連的端粒結(jié)合蛋白（telomere binding protein）［1］。端粒是一種保護(hù)性結(jié)構(gòu)，不具有編碼蛋白質(zhì)的功能，但在維持染色體末端穩(wěn)定及避免染色體被核酶降解等方面起重要作用。在人類衰老及慢性病中都伴有端粒的縮短［2-5］，端粒縮短被認(rèn)為是細(xì)胞衰老的生物學(xué)標(biāo)志。端粒酶（telomerase）是一種核糖核蛋白 DNA聚合酶，它是一種自身攜帶RNA組分為復(fù)制模板的罕見的逆轉(zhuǎn)錄酶，其主要功能是合成端粒，以維持端粒長度的穩(wěn)定性［1］。端粒酶變異會(huì)導(dǎo)致端?？s短，從而影響組織的穩(wěn)態(tài)維持，使人［6］和小鼠［7，8］的壽命縮短。端粒酶基因敲除小鼠沒有端粒酶基因，隨著傳代次數(shù)的增加，端粒逐漸縮短，第三代端粒酶基因敲除小鼠即為短端粒小鼠，其衰老具有端粒依賴性［8］。Jiang等以第四代端粒酶基因敲除小鼠為模型，研究發(fā)現(xiàn)在端粒損傷老齡小鼠中，有4種蛋白高表達(dá)，是端粒功能缺陷及DNA損傷引起的衰老和疾病相關(guān)的生物標(biāo)記物，Cramp蛋白為其中之一［9］。

小鼠Cramp蛋白是由Gallo等［10］首先分離鑒定的，該類蛋白與之前在人、豬、牛、兔、羊等動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽前體，具有高度保守的區(qū)域即 cathelin，因此，將這一大類抗菌肽命名為 cathelicidins。目前已知其主要功能是抗菌活性，此外，還具有抑制組織損傷、促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)、結(jié)合內(nèi)毒素、誘導(dǎo)血管生成等多種生物學(xué)功能。炎性衰老是目前國際衰老理論的研究熱點(diǎn)［11-13］，Cramp蛋白作為一種炎癥因子，在老齡短端粒模型小鼠中高表達(dá)，而正常老齡野生型小鼠中其表達(dá)量未見明顯升高［9］，該蛋白在衰老中的作用值得深入研究。本研究中，我們應(yīng)用12月齡 Cramp過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠和同齡野生型小鼠進(jìn)行了初步研究，以了解該基因在衰老過程中對(duì)不同組織器官的影響，為深入研究Cramp在衰老中的作用和機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 Cramp高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠

該小鼠由本所構(gòu)建并繁育［SCXK（京）2009-0007］。動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF動(dòng)物房?jī)?nèi)，脫頸椎處死后，取組織進(jìn)行流式分析、分選。

1.2 PCR方法鑒定Cramp轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型

用2周齡小鼠尾尖提取基因組DNA，PCR鑒定基因型。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的 PCR鑒定引物：上游引物為5＇GGCTGTGGCGGTCACTATC 3＇，下 游 引 物 為 5＇TCACCACCCCCTGTTCCTT 3＇，產(chǎn)物長度271 bp，引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，PCR試劑購自寶生物工程有限公司。

1.3 流式分析

小鼠脫頸椎處死后，取脾臟、胸腺，置于冰上預(yù)冷的染色緩沖液（含1％BSA的PBS）中，脾臟縱剖成2份，1份用10％中性福爾馬林溶液固定，1份用載玻片研磨成細(xì)胞懸液；胸腺用載玻片研磨成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液用50μm尼龍濾膜過濾后收集到15 m L離心管中，用 PBS定容至10 m L，混勻后，取10μL細(xì)胞液，稀釋10倍后計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞懸液離心，1000 rpm，10 m in，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×108細(xì)胞/mL。分別取106細(xì)胞標(biāo)記熒光抗體（BD公司）。

骨髓及脾臟細(xì)胞的分析中用 B220-FITC、CD115-PE、CD4-Pcrcp-cy5.5、CD8-Pcrcp-cy5.5、Gr1-PE-Cy7、CD11c-APC、CD11b-APC-Cy7，分別標(biāo)記 B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞；CD71-PE、Ter119-APC，標(biāo)記不同發(fā)育階段的紅細(xì)胞比例；IgD-FITC、CD43-PE、B220-PE-Cy7、IgM-APC，標(biāo)記不同發(fā)育階段的B淋巴細(xì)胞；CD34-FITC、Flt3-PE、IL7R-Pcrcpcy5.5、Sca1-PE-Cy7、cKit-APC、Ter-119-Bio、Gr-1-Bio、Mac-1-Bio、B220-Bio、IL-7R-Bio、CD4-Bio、CD8-Bio、Bio-APC-Cy7，標(biāo)記骨髓造血干細(xì)胞。上述抗體加入細(xì)胞懸液，冰上避光，30 min；加1 m L染色緩沖液，離心，2600 rpm，5 m in，棄上清，加200μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，用50μm尼龍濾膜過濾，冰上避光備用。

胸腺細(xì)胞用 CD8-FITC、CD4-APC，CD3-PerCPCy5.5分別標(biāo)記 CD8+、CD4+、CD3+細(xì)胞，冰上避光，30 min；加200μL染色緩沖液，離心，2600 rpm，5 min，棄上清，加200μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，用50 μm尼龍濾膜過濾，冰上避光備用。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

組間資料分析采用Student t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Cramp過表達(dá)對(duì)造血系統(tǒng)的影響

為了解Cramp過表達(dá)對(duì)造血系統(tǒng)的影響，我們分析了Cramp+轉(zhuǎn)基因小鼠和野生對(duì)照小鼠的骨髓、胸腺、脾臟等組織的細(xì)胞組成情況。結(jié)果顯示Cramp過表達(dá)對(duì)小鼠骨髓、脾臟的B220+淋巴細(xì)胞、CD11b+Gr1+細(xì)胞的比例沒有影響，骨髓中造血干細(xì)胞（c-kit+、sca1+、lin-，KSL）沒有影響，對(duì)胸腺各類T淋巴細(xì)胞的比例也沒有明顯影響（圖1）。

2.2 Cramp過表達(dá)對(duì)骨髓造血干細(xì)胞克隆形成能力的影響

圖1 骨髓、脾臟、胸腺細(xì)胞流式分析圖Fig.1 Analysis of bonemarrow，spleen and thymus

圖2 骨髓、脾臟、胸腺中各種細(xì)胞所占比例Fig.2 Percentages of different cells in bone marrow，spleen and thymus

為了進(jìn)一步研究 Cramp過表達(dá)對(duì)骨髓造血干細(xì)胞分化能力的影響，我們分選出單個(gè)骨髓造血干細(xì)胞（ckit+、sca1+、lin-）進(jìn)行體外培養(yǎng)，結(jié)果顯示Cramp過表達(dá)對(duì)骨髓造血干細(xì)胞克隆形成能力無明顯影響。

3 討論

已有研究發(fā)現(xiàn)Cramp蛋白是端粒損傷引起的衰老的生物標(biāo)記物［9］，為研究Cramp對(duì)骨髓造血干細(xì)胞的影響，我們構(gòu)建了CMV-Cramp過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠［14］。本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)，分析了脾臟、胸腺、骨髓等組織器官中各類細(xì)胞的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常生理狀態(tài)下，與同齡野生型小鼠相比，Cramp過表達(dá)小鼠脾臟、骨髓中B細(xì)胞、粒細(xì)胞及紅細(xì)胞的比例沒有顯著差異，這說明Cramp過表達(dá)對(duì)骨髓造血干細(xì)胞的發(fā)育分化沒有顯著影響；對(duì)胸腺細(xì)胞的分析發(fā)現(xiàn)，Cramp過表達(dá)小鼠各類T細(xì)胞的比例與野生型相比沒有顯著差異，可見，Cramp過表達(dá)對(duì)T細(xì)胞的發(fā)育沒有顯著影響；同時(shí)分選骨髓造血干細(xì)胞，并進(jìn)行體外單克隆形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Cramp過表達(dá)對(duì)骨髓造血干細(xì)胞的數(shù)量及自我更新能力沒有顯著影響。

圖3 骨髓造血干細(xì)胞克隆形成能力Fig.3 Colony Form ing potential of HSCs

通過本研究，未發(fā)現(xiàn)Cramp過表達(dá)對(duì)小鼠造血系統(tǒng)有明顯影響，這可能有以下原因：一方面，本研究中，Cramp過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠尚未完全導(dǎo)入C57BL/6J背景，這種雜合背景可能會(huì)影響Cramp過表達(dá)的表型；另一方面，本研究中，未分離Cramp過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性骨髓移植及連續(xù)移植實(shí)驗(yàn)，競(jìng)爭(zhēng)性骨髓移植是評(píng)價(jià)造血干細(xì)胞造血重建能力和長期自我更新能力的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)。因此，Cramp過表達(dá)對(duì)骨髓造血干細(xì)胞的影響，還需在C57BL/6J純合背景下，通過競(jìng)爭(zhēng)性骨髓移植及連續(xù)移植實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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