鄭春蘇 鄒 燕 黃湘寧 黃清松

腎小球?yàn)V過率(glomerular filtration rate，GFR)是檢測腎功能最直接指標(biāo)，常用肌酐清除率(Ccr)來評價[1]。由于其測量方法復(fù)雜，臨床上常用血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)來間接反映腎功能[2]，這兩個指標(biāo)容易受年齡、性別、體重、飲食攝入等因素的影響，并且其評價腎功能不全的敏感度較低，有報道當(dāng)腎小球?yàn)V過率下降超過50%時才能導(dǎo)致血Cr輕微上升[3]。胱抑素C(Cystatin C，Cys-C)是一種小分子蛋白[4]，又稱半胱氨酸蛋白酶抑制劑C[5]，由體內(nèi)有核細(xì)胞產(chǎn)生，速率較穩(wěn)定，不受個體、肌肉量、性別、年齡、腎前因素和慢性炎癥的影響[6]。近年來文獻(xiàn)報道，循環(huán)血液中的Cys-C幾乎僅經(jīng)腎小球過濾而被清除，其血液中的濃度能夠較準(zhǔn)確地反映GFR[7]，它可以自由通過腎小球?yàn)V過，并且腎小管不分泌排泄,幾乎全部在腎小管重吸收后被分解代謝[8]；血清Cys-C比Cr和Ccr對反映GFR的變化具有更高的敏感性和特異性，能夠替代Cr和Ccr而作為GFR變化的理想的內(nèi)源性標(biāo)志物指標(biāo)[9-13]。

由于血清中Cys-C濃度較低，故其測定方法需較高的分析靈敏度及特異性。Cys-C的測定方法很多，如最早由Lofberg使用的單向免疫擴(kuò)散法(RID)和酶免疫測定法(EIA)，以及后來的放射免疫法(RIA)和熒光免疫法(FIA)[14]。前兩種方法不僅費(fèi)時，檢測限也較差；后兩種方法簡單、靈敏，但需要特定儀器，儀器價格昂貴，并且測定時間較長，無法滿足常規(guī)、快速檢測要求。同時，RIA還對環(huán)境有污染，對操作人員有傷害。以上各種測定方法均屬非均相測定方法，很難自動化，因此，限制了Cys-C廣泛的臨床應(yīng)用。目前國內(nèi)外已經(jīng)有很多公司能夠生產(chǎn)膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法(PETIA)Cys-C測定試劑盒。由于這種方法是一種均相測定方法，不需要特殊的儀器,在普通的生化分析儀上就能檢測[15]，自動化程度高，耗時少、操作簡便，所以成為理想的臨床常規(guī)檢測方法。

建立一個新的分析方法，或引進(jìn)新的方法、試劑和儀器，都應(yīng)對它們的技術(shù)性能如精密度、方法比較、線性范圍以及干擾等作出評價[16-17]。美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)制定了一套評價方案(EP5-A、EP9-A、EP6-A和EP7-A文件)能客觀而正確地對上述技術(shù)性能作出評價。

本臨床實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備使用現(xiàn)成的HITACHI 7100全自動生化分析儀將膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法引進(jìn)到Cys-C的日常檢測工作中，在常規(guī)應(yīng)用之前對其技術(shù)性能在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行了嚴(yán)格的評價，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

(1)HITACHI 7100全自動生化分析儀(日本日立公司)；Sysmex KX-21全自動血細(xì)胞分析儀(日本東亞公司)。

(2)膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法試劑、校準(zhǔn)品和室內(nèi)質(zhì)控品,由浙江省金華市強(qiáng)盛生物科技有限公司提供。

1.1.2 標(biāo)本

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來源于本院門診或住院患者、體檢者。①血紅蛋白液(100 g/L)；②收集體檢者的用EDTA抗凝的新鮮全血標(biāo)本，用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞5次，離心去除上清液，加入適量蒸餾水溶解紅細(xì)胞，測定血紅蛋白濃度，選取100 g/L備用。

1.2 方法

1.2.1 膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法的檢測原理

血清中的Cys-C與試劑中的抗人Cys-C抗體膠乳顆粒發(fā)生凝集反應(yīng)，使反應(yīng)溶液濁度增加。其濁度的增加值與血清中Cys-C的濃度呈正比，在波長546 nm處檢測吸光度的變化，并與標(biāo)準(zhǔn)品對照，可計算出Cys-C的濃度。

1.2.2 主要分析參數(shù)

樣本體積4.0 μl；R1體積120 μl；R2體積30 μl；主波長546 nm；副波長800 nm；兩點(diǎn)終點(diǎn)法；反應(yīng)方向?yàn)橄蛏?；反?yīng)溫度為37 ℃；第16個讀光點(diǎn)讀取A1；第34個讀光點(diǎn)讀取A2；待測標(biāo)本吸光度A=A2-A1。

1.2.3 操作方法

先定期請廠家進(jìn)行儀器校準(zhǔn)，檢測參數(shù)和程序均按照膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法試劑盒與儀器說明書進(jìn)行設(shè)置，然后用試劑相配套的校準(zhǔn)品進(jìn)行項(xiàng)目定標(biāo)，每天檢測高、中值室內(nèi)質(zhì)控品，共20 d,計算均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，確認(rèn)本儀器本項(xiàng)目的質(zhì)控允許范圍。檢測高、中值室內(nèi)質(zhì)控品，確認(rèn)在控后進(jìn)行準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍和干擾因素4項(xiàng)評價試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 準(zhǔn)確度回收試驗(yàn)

參考第3版全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[16]。制備2份不同Cys-C濃度的患者混合血清作為基線標(biāo)本，向每一份1.8 ml的混合基線標(biāo)本中分別加入0 μl、100 μl、200 μl Cys-C高值校準(zhǔn)品(8.90 mg/L)，再分別加入200 μl、100 μl、0 μl生理鹽水。將上述6份體積均為2.0 ml的標(biāo)本，用(膠乳增強(qiáng))免疫透射比濁法進(jìn)行4次重復(fù)檢測并計算平均值。通過測量值減去各自基線值確定回收量，回收率為回收量除以加入量乘以100獲得。計算4個回收率的平均值為97.1%。

2.2 精密度試驗(yàn)

參考NCCLS評價方案(EP5-A文件)[17]。選擇2例患者混合血清標(biāo)本(正常值1例,高值1例)，每天測定2次(2次測定間隔2 h以上),每次測定均做雙份，連續(xù)測定20 d,所有雙份數(shù)據(jù)未發(fā)現(xiàn)離群點(diǎn)，精密度結(jié)果見表1。

表1 膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法測定血清Cys-C的精密度結(jié)果(n=20)

2.3 線性試驗(yàn)

參考NCCLS評價方案(EP6-A文件)[18]。取Cys-C最低值(0.00 mg/L)校準(zhǔn)品為低值標(biāo)本1號,取最高值(8.90 mg/L)校準(zhǔn)品為高值標(biāo)本5號，低高值3∶1混勻?yàn)?號，等量混勻?yàn)?號，1∶3混勻?yàn)?號，5個標(biāo)本均測定4次；取其均值為測得值(Y)與設(shè)定的理論值(X)的直線回歸方程和相關(guān)系數(shù)如下：Y=1.0241X-0.0502，r=0.9996，本試驗(yàn)測定數(shù)據(jù)均未發(fā)現(xiàn)離群點(diǎn), 稀釋變異為可接受(P=0.55，界限值P0.05=0.6841；現(xiàn)P＜P0.05)，線性失控檢查結(jié)果說明線性良好(F=2.93，界限值F0.05=3.29；現(xiàn)F＜F0.05)。上述結(jié)果表明：Cys-C線性范圍為0.00～8.90 mg/L。

2.4 干擾試驗(yàn)

參考NCCLS評價方案(EP7-A文件)[18]。采用“配對差異”試驗(yàn)方法，將新鮮無溶血、無黃疸、無脂濁的混合血清分成2份，其中一份加入1/10體積的100 g/L血紅蛋白液、8840 umol/L膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液或1/2體積的含甘油三酯18 mmol/L的脂肪乳作為測定(高值)標(biāo)本5號；另一份則加入同等體積的生理鹽水作為對照(低值)標(biāo)本1號，低高值3∶1混勻?yàn)?號，等量混勻?yàn)?號，1∶3混勻?yàn)?號，4～5號標(biāo)本分別重復(fù)測定4次, 1號標(biāo)本重復(fù)測定20次，計算1～5號標(biāo)本平均值和1號標(biāo)本標(biāo)準(zhǔn)差(s)，干擾值(2～5號)＝2～5號平均值－1號平均值，干擾值大小在1號對照標(biāo)本95%可信限(±1.96 s)范圍內(nèi)判斷為無顯著性干擾,否則為有顯著性干擾。

試驗(yàn)結(jié)果表明：血紅蛋白(負(fù)干擾)濃度水平≤5 g/L、膽紅素(正干擾)濃度水平≤442 umol/L和三酰甘油(負(fù)干擾)≤9 mmol/L時對Cys-C測定均無顯著性干擾。

3 討論

臨床檢驗(yàn)所選用或所引進(jìn)的分析方法，應(yīng)具備兩個重要的特性：①實(shí)用性：檢測速度快、標(biāo)本用量少、費(fèi)用低廉和安全可行；②可靠性：方法學(xué)的各項(xiàng)技術(shù)性能指標(biāo)必須達(dá)到要求，這是方法選擇或引用中最重要的原則[19]。為了保證檢驗(yàn)質(zhì)量，臨床實(shí)驗(yàn)室在使用新的分析方法進(jìn)行患者標(biāo)本檢測前，必須用實(shí)驗(yàn)去評價它的基本性能。NCCLS評價方案文件對于檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)化具有重要的指導(dǎo)意義[20]。

上述研究結(jié)果顯示，膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法測定血清Cys-C的平均回收率為97.1%，說明準(zhǔn)確度符合要求[19]；批內(nèi)、批間、日間和總變異系數(shù)(CV)符合常規(guī)實(shí)驗(yàn)CV＜5%的要求，說明精密度符合要求；線性范圍較寬(0.00～8.90 mg/L)；干擾因素少。該法采用現(xiàn)成的生化分析儀進(jìn)行檢測,與以前的其他檢測方法相比,有自動化程度高、操作簡便、檢測速度快、標(biāo)本用量少、成本低和因人工操作步驟少而引起的誤差大大減少等優(yōu)點(diǎn)，而且本法所用的試劑本身和反應(yīng)產(chǎn)物對環(huán)境無污染，對操作人員無傷害?？傊z乳增強(qiáng)免疫透射比濁法是目前臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)測定血清Cys-C的首選方法。

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