劉培，張霞，曲鵬，吳冬雪，趙良娟，張海英，高旗利，張宏偉，鄭文杰

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300461）

本研究共采用來(lái)自10 個(gè)不同國(guó)家樣品中分離出來(lái)的阪崎腸桿菌菌株34 株，利用Riboprinter 系統(tǒng)對(duì)這34 株阪崎腸桿菌進(jìn)行基因鑒定，應(yīng)用BioNumerics 軟件對(duì)不同來(lái)源地菌株的基因分型結(jié)果進(jìn)行對(duì)比研究，做出阪崎腸桿菌同一地域和不同地域菌株的親緣圖譜。對(duì)不同地域的阪崎腸桿菌的親緣關(guān)系進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

34 株試驗(yàn)菌株（見(jiàn)表1）；改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素（mLST-Vm）；阪崎腸桿菌檢測(cè)顯色培養(yǎng)基；營(yíng)養(yǎng)肉湯；營(yíng)養(yǎng)瓊脂；VITEK GNI 檢測(cè)試劑；Riboprinter 試劑盒。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Riboprinter 系統(tǒng)：美國(guó)杜邦公司；VITEK32 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)：法國(guó)生物梅里埃；BioNumerics 數(shù)據(jù)庫(kù)軟件5.0：APPLIED MATHS 公司；常規(guī)培養(yǎng)法必備的儀器設(shè)備和器具。

表1 試驗(yàn)菌株Table 1 Bacterial strains for detection

1.3 方法

1.3.1 目標(biāo)菌生化鑒定

根據(jù)GB/T 4789.40-2008《阪崎腸桿菌檢驗(yàn)》對(duì)試驗(yàn)用34 株目標(biāo)菌進(jìn)行增菌培養(yǎng)，在阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基上挑取藍(lán)綠色菌落，接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂，挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的菌落進(jìn)行生化鑒定。生化鑒定選用VITEK32 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)。生化鑒定結(jié)果為試驗(yàn)用34 株目標(biāo)菌全部為阪崎腸桿菌。

1.3.2 目標(biāo)菌16SrDNA 序列分析

根據(jù)《GB/T 4789.40-2008 阪崎腸桿菌檢驗(yàn)》對(duì)試驗(yàn)用34 株目標(biāo)菌進(jìn)行增菌培養(yǎng)，在阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基上挑取藍(lán)綠色菌落，接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂，挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的菌落進(jìn)行基因鑒定。利用Riboprinter 系統(tǒng)對(duì)上述目標(biāo)菌進(jìn)行16SrDNA 序列分析。

加熱元件通常為鉬帶或鉬絲，鉬帶雖然使用壽命長(zhǎng)，可靠性高，但制造成本高。綜合考慮，鉬板加熱電阻爐采用鉬絲作為加熱元件[5]。

1.3.3 應(yīng)用BioNumerics 軟件對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行基因分析

將Riboprinter 系統(tǒng)分析得到的34 株目標(biāo)菌的rRNA 基因指紋圖，與Riboprinter 數(shù)據(jù)庫(kù)比較進(jìn)行基因分型；創(chuàng)建RiboPrinterR模式，從而產(chǎn)生每個(gè)樣品的基因指紋圖譜。將這34 株菌的基因指紋圖譜輸入BioNumerics 軟件，運(yùn)用BioNumerics 數(shù)據(jù)庫(kù)軟件建立相應(yīng)的核糖體指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行指紋圖譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 澳洲和大洋洲

分別以澳大利亞和新西蘭代表澳洲和大洋洲。

圖1 為6 株來(lái)源為澳大利亞的阪崎腸桿菌菌株的親緣關(guān)系圖譜比較。

這6 株菌的基因指紋圖譜的相似性很高，其中編號(hào)為19-1、19-4、12-3、5-4 的這4 株菌的基因指紋圖的相似性在90%以上，可以被認(rèn)為這4 株菌為相似的基因型。另2 株編號(hào)為19-6 和12-2 的菌株與這4 株的相似性也在83%以上。

圖2 為8 株來(lái)源為新西蘭的阪崎腸桿菌菌株的親緣關(guān)系圖譜比較。

圖2 中編號(hào)為5-1、5-3、5-7 的3 株菌的基因指紋圖相似性在90%以上，認(rèn)為基因型相似。編號(hào)為12-5 和19-3 的菌株與上述3 株菌的基因指紋圖相似性為75%以上。而編號(hào)為12-6 的菌株與其他菌株的相似性不到40%，被認(rèn)為親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，不屬于同一種。

圖3 為來(lái)源澳大利亞和新西蘭的菌株的親緣關(guān)系圖譜比較。

這14 株阪崎腸桿菌中的12 株的基因指紋圖譜相似性在75%以上。只有編號(hào)為7-8 和12-6 的2 株菌與其他12 株菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2 美洲

美洲分為北美洲和南美洲來(lái)進(jìn)行分析。北美洲的代表國(guó)家為美國(guó)，南美洲選擇烏拉圭和阿根廷做為代表。

圖4 為5 株來(lái)源美國(guó)的阪崎腸桿菌基因指紋圖譜比較。圖中顯示這5 株來(lái)自美國(guó)的阪崎腸桿菌菌株的親緣關(guān)系都在78%以下，親緣較遠(yuǎn)。

圖5 為5 株來(lái)源南美洲的阪崎腸桿菌基因指紋圖譜比較。其中編號(hào)為6-1、6-2、5-6 和5-8 的菌株來(lái)源烏拉圭，編號(hào)為7-7 的菌株來(lái)源阿根廷。圖中顯示來(lái)源烏拉圭的4 株菌的基因指紋圖相似性在90%以上，具有相似的基因型。而與阿根廷的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，相似性為65%以下。

圖6 為10 株來(lái)源美洲的阪崎腸桿菌基因指紋圖譜比較。

來(lái)源于美國(guó)的編號(hào)為5-5 和12-4 的菌株與來(lái)源于烏拉圭的菌株親緣關(guān)系較近，在80%以上，其他菌株的親緣關(guān)系則較遠(yuǎn)。

2.3 歐洲

圖7 為8 株來(lái)自歐洲的阪崎腸桿菌基因指紋圖譜比較。

其中來(lái)源荷蘭的編號(hào)為12-1、19-5 和來(lái)源奧地利的編號(hào)為19-7、12-8 的4 株菌基因指紋圖相似性在85%以上，具有相似的基因型。同樣來(lái)源荷蘭的12-1 和7-3 為同一樣品荷蘭金裝幼兒成長(zhǎng)奶粉中提取的阪崎腸桿菌，由于生化反應(yīng)不同，因此保存為兩個(gè)菌株。圖7 的結(jié)果表明這2 株菌的基因指紋圖相似性不到40%。

2.4 中國(guó)

來(lái)源于中國(guó)的2 株阪崎腸桿菌為市售奶粉中分離得到。圖8 為這2 株菌的基因指紋圖譜比較。

從圖8 中可以看出這2 株菌的基因指紋圖相似性在50%左右，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.5 不同地域

將全部34 株阪崎腸桿菌進(jìn)行基因指紋圖的對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 中有2 組菌株的基因指紋圖相似性在80%以上。第一組菌株的編號(hào)為12-5、19-6、12-1、19-8、12-8、12-2、19-5、19-7。分別來(lái)自新西蘭、澳大利亞、荷蘭、美國(guó)和奧地利。第二組菌株的編號(hào)為5-1、5-2、5-4、6-1、6-2、5-3、5-5、5-6、5-7、5-8、19-1、19-4、12-3。分別來(lái)自新西蘭、荷蘭、澳大利亞、烏拉圭和美國(guó)。其中第二組中編號(hào)為5-1、5-2、5-4、6-1、6-2 的菌株的基因指紋圖相似性達(dá)到98%以上。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)不同地域阪崎腸桿菌進(jìn)行基因指紋圖譜的分析，可以看出來(lái)源于澳大利亞的阪崎腸桿菌的基因指紋圖譜相似性很高，基本都在90%以上，是基因型相似的阪崎腸桿菌菌株。來(lái)源于新西蘭的阪崎腸桿菌相似性基本在75%以上，親緣關(guān)系也比較接近。由于澳大利亞和新西蘭距離較近，都在南半球，因此將來(lái)源于澳大利亞和新西蘭的菌株的基因指紋圖做了分析，分析發(fā)現(xiàn)85%以上的菌株的指紋圖譜相似性在75%以上。通過(guò)對(duì)來(lái)源于美國(guó)的阪崎腸桿菌基因指紋圖的分析顯示來(lái)源美國(guó)的菌株親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)。而來(lái)源于烏拉圭的菌株基因指紋圖的相似性全部都在90%以上，屬于基因型相似的菌株。從來(lái)自歐洲的菌株基因指紋圖的分析我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)值得注意的結(jié)果就是同為來(lái)源于荷蘭的一份樣品中提取的阪崎腸桿菌菌株，由于生化反應(yīng)不同，其基因指紋圖的相似性很低，親緣關(guān)系很遠(yuǎn)，可以認(rèn)為是克羅諾桿菌屬的兩個(gè)不同種菌株。可以看出生化型的不同對(duì)菌株基因型的影響很大。而中國(guó)市售奶粉由于來(lái)源不明，因此親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。而對(duì)不同來(lái)源地的阪崎腸桿菌菌株的分析表面來(lái)自不同國(guó)家和不同大洲的菌株也可能為同一來(lái)源的菌株。

通過(guò)對(duì)上述結(jié)果的分析，我們發(fā)現(xiàn)來(lái)源澳大利亞和來(lái)源烏拉圭的菌株各自之間的親緣關(guān)系很近，基本屬于相似或相同的基因型。而來(lái)源其他國(guó)家的菌株之間的親緣關(guān)系沒(méi)有什么規(guī)律可循，尤其值得注意的是同一樣品中分離出得到兩個(gè)種的阪崎腸桿菌菌株。而來(lái)自不同國(guó)家和不同大洲的菌株也可能為同一來(lái)源的菌株。

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