魯吉珂，楊艷坤，司艷紅，關(guān)方霞

(鄭州大學(xué)生物工程系 河南 鄭州 450001)

帕金森病(Parkinson’s Diease，PD)是中老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病，其發(fā)生與黑質(zhì)紋狀體中多巴胺含量減少有關(guān)。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)屬神經(jīng)營養(yǎng)素(Neurotrophin)家族成員，能夠促進(jìn)多種神經(jīng)元的存活，尤其對(duì)多巴胺能神經(jīng)元有很強(qiáng)的營養(yǎng)和保護(hù)作用，并參與PD的發(fā)病與病理進(jìn)程，被認(rèn)為是治療PD的新一代藥物［1］。但因?yàn)锽DNF為大分子物質(zhì)，不能透過血腦屏障，腦室內(nèi)用藥又極其不方便，給臨床的應(yīng)用帶來很大困難。

蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域家族是自然界中天然存在的一類多肽，能夠安全高效地實(shí)現(xiàn)多種外源生物大分子的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)［2］。構(gòu)建轉(zhuǎn)導(dǎo)肽與BDNF融合蛋白，可實(shí)現(xiàn)BDNF跨膜運(yùn)輸并達(dá)到對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療目的，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道較多。本文從細(xì)胞穿透肽和BDNF融合蛋白的國內(nèi)外研究方面展開綜述，旨在為開發(fā)基于BDNF融合蛋白相關(guān)藥物研究提供參考。

1 細(xì)胞穿透肽

細(xì)胞穿透肽(Cell penetrating peptide，CPP)，又稱蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(Protein tansduction domain，PTD)，是一類具有跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的小分子肽段，能以非能量、非受體依賴性的方式把生物大分子跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)入各種細(xì)胞內(nèi)［3］。目前已發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞穿透肽主要包括人類免疫缺陷病毒1型(Human imunodeficiency virus type 1，HIV-1)編碼的反式轉(zhuǎn)錄激活因子TAT、果蠅同源異型轉(zhuǎn)錄因子ANTP、單純皰疹病毒1型(HSV-1)轉(zhuǎn)錄因子VP22和人工合成的多聚精氨酸及多聚賴氨酸等［2］。

CPP一般分為3類:蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域PTD，模型多肽和設(shè)計(jì)多肽。PTD是來源于特定天然蛋白片段具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的肽段，如TAT;模型多肽是模仿已知結(jié)構(gòu)CPPs的氨基酸序列，如多精氨酸;設(shè)計(jì)多肽是根據(jù)特定需要設(shè)計(jì)不同來源多肽片段［4］。不同來源的CPP并沒有相似的氨基酸序列，其共同點(diǎn)是為正電荷或兩性分子［4］。滿足實(shí)際應(yīng)用的CPP分子應(yīng)當(dāng)滿足下列條件:①小分子，易于合成;②易于和多種分子結(jié)合，不改變其轉(zhuǎn)導(dǎo)性能;③對(duì)組織、細(xì)胞具有較高的選擇性;④穩(wěn)定性好，毒性及副作用?。?］。

CPP及其結(jié)合的生物大分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)是目前研究的熱點(diǎn)，截至2012年3月13日，Pubmed中題目或摘要中含有CPP的文獻(xiàn)有523篇，研究較多集中在TAT和ANTP上，見表1。據(jù)法國學(xué)者 Vivès在2008年的報(bào)道，關(guān)于TAT和ANTP的文獻(xiàn)占CPP的文獻(xiàn)75%以上［5］。值得注意的是，作為一種藥物運(yùn)輸體系，CPP分子的毒性必須要考慮。目前體外毒性研究較多，而活體毒性報(bào)道相對(duì)較少。盡管尚未發(fā)現(xiàn)CPP的毒性和不良反應(yīng)，但英國學(xué)者Bolton等報(bào)道稱當(dāng)10μg或者更高劑量的跨膜肽注射大鼠時(shí)，可檢測到腦細(xì)胞炎癥和神經(jīng)細(xì)胞死亡現(xiàn)象，而劑量降低到1 μg時(shí)，上述效應(yīng)大大降低［6］。

表1 Pubmed數(shù)據(jù)庫相關(guān)文獻(xiàn)檢索結(jié)果

2 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)

BDNF是1982年德國神經(jīng)生物學(xué)家Barde等從豬腦中分離出來的小分子蛋白質(zhì)，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。BDNF不僅對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育、增殖分化、存活起重要作用，而且對(duì)神經(jīng)元損傷后的再生修復(fù)與功能重塑也起了重要作用［7，8］。因此，BDNF 在神經(jīng)系統(tǒng)疾病如PD的治療上有重要的應(yīng)用前景。但應(yīng)用BDNF治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病時(shí)，主要存在2個(gè)問題。一是人BDNF天然含量極低，每千克組織僅可提取得到微克水平的BDNF，目前尚未找到豐富的組織來源［9］;另一方面，由于存在血腦屏障，BDNF無法進(jìn)入大腦發(fā)揮生物活性，限制了其應(yīng)用。腦內(nèi)直接注射BDNF需反復(fù)給藥、易造成顱內(nèi)感染，直接應(yīng)用攜帶BDNF基因的質(zhì)粒存在表達(dá)不足，而腺病毒又存在安全隱患問題［10］。

通過基因工程手段來制備高純度BDNF，成本較低，有望解決BDNF來源問題。結(jié)合細(xì)胞穿透肽跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，采用基因工程方法表達(dá)并純化得到BDNFPTD融合蛋白，將具有治療作用的BDNF透過血腦屏障而發(fā)揮生物效能，有望解決BDNF給藥問題。關(guān)于BDNF-PTD融合蛋白研究，國內(nèi)文獻(xiàn)較多，如裴明軍等［8］構(gòu)建含PTD與 BDNF融合基因的質(zhì)粒，并在大腸肝菌中表達(dá)，PCR擴(kuò)增PTD-BDNF融合基因，經(jīng)DNA測序無誤后插入表達(dá)質(zhì)粒pJW2構(gòu)建質(zhì)粒pJPB，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并進(jìn)行PTD-BDNF蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化。石秦東等［8］構(gòu)建以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)為報(bào)告基因的BDNF融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒，并對(duì)其表達(dá)和定位進(jìn)行研究［11］。英文期刊中關(guān)于BDNF融合蛋白文獻(xiàn)相對(duì)較少，Zhou等［12］將人BDNF與PTD融合表達(dá)后，并重點(diǎn)對(duì)融合蛋白PTD-BDNF對(duì)小鼠腦損傷的保護(hù)作用進(jìn)行研究。關(guān)于BDNF的文獻(xiàn)總結(jié)見表2。但總的來說，目前關(guān)于BDNF的文獻(xiàn)仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，臨床應(yīng)用的報(bào)道非常少。

表2 關(guān)于BDNF融合蛋白相關(guān)文獻(xiàn)總結(jié)

3 融合蛋白表達(dá)載體構(gòu)建

目前融合蛋白表達(dá)載體研究集中在原核表達(dá)載體，如pET系列，pTAT等。這些表達(dá)載體部分為直接商品化產(chǎn)品，部分為研究者自行構(gòu)建。真核表達(dá)載體研究相對(duì)較少，此外，還有一部分化學(xué)合成的融合蛋白。原核表達(dá)簡單快捷，表達(dá)量大，有多種載體和菌種可供選擇，可以多個(gè)基因一起表達(dá)，技術(shù)也較為成熟，但其缺點(diǎn)是無法對(duì)蛋白進(jìn)行翻譯后的修飾，一些來源于高級(jí)生物的蛋白在原核系統(tǒng)中無法正常折疊，以包涵體的形式存在，需要復(fù)雜的蛋白復(fù)性過程;真核表達(dá)載體具有轉(zhuǎn)錄后加工功能，產(chǎn)物以可溶活性蛋白形式存在，提取純化成本較低，但其表達(dá)量相對(duì)較低，周期較長，載體價(jià)格也較貴［15］。

化學(xué)交聯(lián)的融合蛋白其結(jié)構(gòu)便于控制，有利于研究其結(jié)構(gòu)與膜穿透機(jī)理。另外，化學(xué)交聯(lián)法可制備多種結(jié)構(gòu)的新型CPP融合蛋白，如含有非基因編碼氨基酸D-氨基酸的融合蛋白，但該方法目前研究較少［16］。關(guān)于融合蛋白相關(guān)表達(dá)載體構(gòu)建的文獻(xiàn)總結(jié)見表3。

4 細(xì)胞靶向穿膜肽

CPP能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)各種生物大分子進(jìn)入各類細(xì)胞，但因缺乏細(xì)胞特異性，有可能對(duì)正常組織和細(xì)胞造成毒害作用。通過細(xì)胞靶向肽(Cell-targeting peptides)，可提高多肽的細(xì)胞特異性。因此將靶向載體與CPP結(jié)合起來，尋求具有靶向作用的CPP并構(gòu)建融合蛋白，可結(jié)合兩者優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)靶向和跨膜兩種功能，是未來研究的一個(gè)方向［5］。李海玉等［34］成功構(gòu)建了基于細(xì)胞穿透肽的蛋白表達(dá)運(yùn)輸載體pET14b-HC(L)NE(pET14b-His-CPP-Linker-NLS-EGFP)，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示得到融合蛋白可快速穿透細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞核;該蛋白表達(dá)載體具有細(xì)胞穿透肽靶向細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)淖饔谩窍蛄岬龋?5］將能夠靶向誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的凋亡素VP3，構(gòu)建到內(nèi)化活性得到提高的改良型穿透肽載體上，構(gòu)建pET14b-VP3-EGFP-TAT表達(dá)載體，得到了具有促凋亡活性的融合蛋白。

5 小結(jié)及展望

目前關(guān)于CPP的研究主要集中在以下3個(gè)方面:①研究CPP結(jié)構(gòu)，揭示其跨膜原因，進(jìn)而研究發(fā)現(xiàn)新的具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的CPP，并提高其跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。如 Eiríksdóttir等［33］對(duì)10種常用 CPP 分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較進(jìn)行研究，考察了CPP對(duì)磷脂膜的作用，并據(jù)此對(duì)CPP分子進(jìn)行重新分類;②CPP跨膜機(jī)理研究，該部分研究文獻(xiàn)較多，但尚未有統(tǒng)一的結(jié)論;③拓展CPP在生物大分子物質(zhì)跨膜運(yùn)輸中的應(yīng)用［23，30］。

綜上所述，細(xì)胞穿透肽是一種有力的跨膜工具，將其與靶向肽結(jié)合起來，構(gòu)建具有靶向作用的CPP-BDNF融合蛋白，有助于BDNF透過血腦屏障，直接靶向運(yùn)送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，從而為PD治療提供新思路。

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