梁碩，史辛藝，王志斌，關方霞，2

(1.鄭州大學生物工程系 河南 鄭州 450001;2.河南省醫(yī)學科學院 河南 鄭州 450003)

唇腭裂是新生兒口腔頜面部最常見的一種先天性發(fā)育畸形，其發(fā)病率因地域、人種和民族而異，我國的發(fā)生率約為0.182%，居新生兒出生缺陷發(fā)生率的首位［1］。唇腭裂分為綜合征型和非綜合征型兩種，綜合征型唇腭裂是指以某綜合征的表型之一出現(xiàn)的，通常多由單個基因突變引起;而非綜合征型唇腭裂(nonsydromic cleft of lip with or without palate，NSCL/P)，是指單發(fā)的唇裂、腭裂或唇裂合并腭裂，是一種排除了其他系統(tǒng)畸形和綜合征的唇腭裂，占唇腭裂的70%以上。NSCL/P的病因比較復雜，目前認為它是由遺傳和環(huán)境因素相互作用所致的一種多基因多因素遺傳病?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)與唇腭裂相關基因有很多，常見的有 BCL3，TGFA，TGF-β3 等，其中轉(zhuǎn)化生長因子-3(transforming growth factor-β，TGF-β3)是腭突發(fā)育過程中的關鍵因子之一。因此本文就TGF-β3基因與腭裂發(fā)生的相關研究進展進行綜述，以期為深入研究該病的病因提供參考依據(jù)。

1 TGF-β3在腭發(fā)育過程中的作用

TGF-β3基因位于14q24，大小為43 kb，含6個內(nèi)含子和7個外顯子，編碼一系列TGF-β家族蛋白，參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)生和細胞分化，它是TGF-β家族中非常重要的一員。TGF-β家族在腭發(fā)育過程中調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡，細胞移行，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，細胞外基質(zhì)的合成及沉積，基底膜的降解等。在哺乳動物中TGF-β 有3 種亞型:TGF-β1、TGF-β2 和 TGF-β3。盡管3種亞型結構相似，含7l%～76%相同的基因序列，都通過Smads或MAPKs信號通路，并且在不同種族間具有高度保守性，但它們在腭突發(fā)育過程中的作用卻是各不相同的。研究表明，TGF-β3基因缺陷小鼠往往都形成腭裂，提示TGF-β3在兩側(cè)腭突的融合過程中起主要作用;TGF-β2基因缺陷小鼠多有上頜骨和下頜骨畸形，其中腭裂的發(fā)生率為23%;TGF-β1基因缺陷小鼠在胚胎第11天之前死亡，無法研究其在上腭發(fā)育中的作用［2］。

1.1 腭的發(fā)育過程 胚胎早期原始鼻腔和口腔是彼此相通的，腭的發(fā)育使口腔與鼻腔分開。胚胎發(fā)育至第9周左右時，兩側(cè)的側(cè)腭突與前腭突自外向內(nèi)、向后方向生長，最后形成完整的大部分硬腭、軟腭和懸雍垂，將口腔與鼻腔完全隔開。整個過程包括兩側(cè)腭突的生長、上抬、粘附及融合等。其中腭突中嵴上皮(medical edge epithelia，MEE)細胞在腭突融合過程中顯得尤為重要:首先是其外層上皮細胞從腭突接觸點開始發(fā)生程序性細胞死亡脫落，然后通過側(cè)腭突內(nèi)細胞的緊密接觸形成腭中線，側(cè)腭突發(fā)生向水平方向的轉(zhuǎn)動并向中線生長。MEE細胞進一步通過細胞凋亡、分化及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等途徑降解。腭中線隨著細胞的降解而消失，間充質(zhì)細胞在中線處融合，形成完整的腭［3］。腭的發(fā)育過程受許多因素的影響，可能出現(xiàn)發(fā)育異常從而導致腭裂或頜裂。

1.2 TGF-β3在胎鼠腭發(fā)育過程中的表達 小鼠孕11～16 d相當于人類的孕6～12周，該時期是腭部發(fā)育的關鍵時期。孕11.0～11.5 d，上頜突長出腭突并垂直延伸，此時TGF-β3僅在上皮細胞中表達，并持續(xù)表達至上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化結束、MEE細胞消失為止。孕12.0～12.5 d，腭突仍呈垂直生長，可分別在上皮及間充質(zhì)細胞中檢測到 TGF-β1和 TGF-β2的表達。孕13.0～13.5 d，腭突抬高，TGF-β3 在上皮細胞中表達升高，促進了腭中線的形成［4］。孕14.0～14.5 d，兩側(cè)腭突接觸前MEE細胞中的TGF-β3表達水平開始迅速升高，口腔樣上皮及鼻腔樣上皮中也有TGF-β3表達。TGF-β1和TGF-β3在同種上皮細胞中均有表達，TGF-β2則在間充質(zhì)細胞中持續(xù)表達，少量MEE細胞中也有 TGF-β2 表達［4］。腭中線形成后，TGF-β3 表達水平達最高峰，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化活躍。孕15.0～15.5 d，腭突開始聯(lián)會融合，MEE細胞持續(xù)表達TGF-β1和TGF-β3，直至MEE細胞完全失去其上皮表型轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細胞［4］，但與孕 13.5～14.5 d 相比，尚未完成轉(zhuǎn)化的上皮細胞TGF-β3的表達量明顯減少［4］，腭中線兩側(cè)的間充質(zhì)細胞TGF-β2持續(xù)高表達［5］。孕16.0～16.5 d，融合后的腭組織中只含少量表達TGF-β3的上皮細胞，TGF-β3主要在間充質(zhì)細胞中表達;TGF-β2在中線兩側(cè)間充質(zhì)細胞中廣泛表達，而TGF-β1只在腭突和鼻突的骨化區(qū)表達。

2 TGF-β3在腭發(fā)育過程中的作用機制

目前，研究發(fā)現(xiàn)TGF-β3在腭發(fā)育過程中，對腭突生長和抬高的作用不大，主要作用于腭突的融合過程。Taya等［3］第一次提出 TGF-β3是通過誘導 MEE細胞表面絲足的形成來促進腭突融合的，并將其作用機制闡明如下:①絲足使MEE細胞的表面積增大，有利于腭突接觸粘附;②絲足富集大量的細胞粘附分子和細胞橋粒為腭突接觸粘附提供便利;③絲足能使MEE細胞表面電荷減少，對腭突接觸和粘附十分重要;④絲足能使細胞轉(zhuǎn)化能力增強，有利于MEE細胞轉(zhuǎn)化為口腔樣上皮或鼻腔樣上皮及上皮間充質(zhì)，促使腭中線降解。新近研究［6］發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，在腭突接觸前，TGF-β3基因缺陷小鼠MEE細胞中的某些細胞外基質(zhì)分子和細胞粘附分子表達異常。而在體外實驗中添加外源性TGF-β3可恢復TGF-β基因缺陷小鼠MEE細胞中上述分子的表達量及分布，可促進腭突融合。

腭中線降解是腭突融合過程中十分關鍵的一環(huán)。目前關于腭中線降解機制的研究較多，但分歧較大，主要集中在細胞移行途徑和細胞程序性死亡途徑兩點上。Murillo等［7］認為腭中線降解僅經(jīng)過細胞移行途徑，而Dudas等［8］認為腭中線降解僅經(jīng)過細胞程序性死亡途徑。盡管對腭中線降解途徑的認識存在分歧，但他們一致認同不管是細胞移行還是細胞程序性死亡均為TGF-β3所誘導。而 Ahmed等［9］研究發(fā)現(xiàn)，細胞移行和細胞程序性死亡都參與了TGF-β3誘導的腭中線降解，其始發(fā)反應為細胞周期停滯，還發(fā)現(xiàn)上述3個反應是有序而獨立的過程。Iordanskaia等［10］進一步研究發(fā)現(xiàn)，細胞周期停滯是上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細胞凋亡的先決條件，處于G1/S期的細胞進入上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，處于G2/M期的細胞發(fā)生細胞凋亡。細胞周期停滯主要由TGF-β1基因誘導，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細胞凋亡主要由TGF-β3基因誘導，而上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細胞凋亡的同時還受到多種信號分子的調(diào)控，如p38MAPK、TGF-β 受體、Smads、STAT3 及 PKA 等［11］。

3 TGF-β3基因的多態(tài)性與腭裂發(fā)生的相關性

TGF-β3基因與腭裂發(fā)生相關的認識基于對基因敲除小鼠的研究。Kaariene等［2］和 Taya等［3］研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β3-/-小鼠表現(xiàn)為腭裂畸形，但無其他顱面畸形發(fā)生。Brunet等［12］應用TGF-β3抗體及反義寡核苷酸抑制 TGF-β3，可阻斷正常小鼠腭板的融合。而Yang和Lee［13］研究發(fā)現(xiàn)，在雞胚腭裂模型中添加外源性TGF-β3，可誘導其腭板融合。

關于TGF-β3基因多態(tài)性與人類NSCL/P關系的研究報道結果各不相同。國內(nèi)朱江輝等［14］對170個NSCL/P核心家庭成員DNA標本進行TGF-β3 CA重復序列多態(tài)性檢測。經(jīng)傳遞不平衡檢驗和基于單體型的單體型相對危險度檢驗分析，未發(fā)現(xiàn)TGF-β3 CA重復序列多態(tài)性與NSCL/P發(fā)生之間有關系，但應用家系為基礎的相關性檢驗分析發(fā)現(xiàn)TGF-β3基因突變與NSCL/P發(fā)病危險之間有關聯(lián)。林健燕等［15］對200例NSCL/P患者各基因位點多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn) TGF-β3 G15572多態(tài)性與母親妊娠早期被動吸煙、感染史、補充維生素及父親知曉妊娠前吸煙、飲酒對NSCL/P的發(fā)生具有交互作用。而劉寧等［16］對48例NSCL/P患者的TGF-β3基因SfaNI多態(tài)性進行檢測，發(fā)現(xiàn)其與中國人群 NSCL/P發(fā)生無關。國外Suazo等［17］對智利150例NSCL/P患者及其父母的TGF-β3基因進行等位基因遺傳不平衡檢驗，發(fā)現(xiàn)TGF-β3基因多態(tài)性與NSCL/P有關。但Marazita等［18］針對多國820個家庭6565例的標本進行了連鎖分析，結果卻未發(fā)現(xiàn)TGF-β3基因多態(tài)性與NSCL/P相關。有研究表明，先天性腭裂患者TGF-β3基因很少發(fā)生突變［19］，僅表現(xiàn)為表達水平的改變。Nogai［20］、Gan［21］、柴茂洲等［22］在動物實驗中也得出了相同的結論。提示TGF-β3基因表達異常與腭裂發(fā)生具有相關性，其機制可能與該基因DNA甲基化等表觀遺傳現(xiàn)象有關。

4 總結與展望

在動物實驗中，TGF-β3基因在胚胎腭發(fā)育的關鍵時期表達，并參與腭突融合的調(diào)控，因此，TGF-β3基因突變與腭裂的發(fā)生具有明確的因果關系。但在臨床研究中，TGF-β3基因的多態(tài)性與腭裂相關性的研究結果卻不相同，這可能與地域、種族及研究方法的差異有關。而TGF-β3基因在胚胎時期腭發(fā)育過程中的作用機制尚未闡明，腭裂發(fā)生是否與環(huán)境-基因相互作用有關也需進一步研究。

［1］Forrester M B，Merz R D.Descriptive epidemiology of oral clefts in a multiethnic population，Hawaii，1986-2000［J］.Cleft Palate Craniofac J，2004，41(6):622-628.

［2］Kaartinen V，Voncken J W，Shuler C，et al.Abnormal lung development and cleft palate in mice lacking TGF-β3 indicates defects of epithelial-mesenchymal interaction［J］.1995，11(4):415-421.

［3］Taya Y，O'Kane S，F(xiàn)erguson M W.Pathogenesis of cleft palate in TGF-beta3 knockout mice ［J］.Development，1999，126(17):3869-3879.

［4］Rotzer D，Roth M，Lutz M，et al.Type Ⅲ TGF-beta receptor-independent signaling of TGFbeta2 via TbetaRTI-B，an alternatively spliced TGF-betape Ⅱ receptor［J］.EMBO J，2001，20(3):480-490.

［5］Martinez-Alvarez C，Blanco M J，Perez R，et al.Snail family members and cell survival in physiological and pathological cleft palates［J］.Dev Biol，2004，265(1):207-218.

［6］Martinez-Sanz E，Del Rio A，Barrio C，et al.Alteration of medial-edge epithelium cell adhesion in two Tgf-beta3 null mouse strains［J］.Differentiation，2008，76(4):417-430.

［7］Murillo J，Maldonado E，Barrio M C，et al.Interactions between TGF-beta 1 and TGF-beta3 and their role in medial edge epithelium cell death and palatal fusion in vitro［J］.Differentiation，2009，77(2):209-220.

［8］Dudas M，Li W Y，Kim J，et al.Palatal fusion-Where do the midline cells go?A review on cleft palate，a major human birth defect［J］.Acta Histochem，2007，109(1):1-14.

［9］Ahmed S，Liu C C，Nawshad A.Mechanisms of palatal epithelial seam disinter-gration by transforming growth factor(TGF)beta-3 ［J］.Dev Biol，2007，309(2):193-207.

［10］Iordanskaia T，Nawshad A.Mechanisms of transforming growth factor b induced cell cycle arrest in palate development［J］.J Cell Physiol，2011，226(5):1415-1424.

［11］Tian H Y，Zhang K H，Gao X，et al.Comparative proteomic analysis of cell cycle-dependent apoptosis induced by transforming growth factorbeta［J］.Biopys Acta，2009，1794(10):1387-1397.

［12］Brunet C L，Sharpe P M，F(xiàn)erguson M W.Inhibition of TGF-beta3(but not TGF-beta 1 or TGF-beta 2)activity prevents normal mouse embryonic palate fusion［J］.Int J Cev Biol，1995，39(2):345-355

［13］Yang B E，Lee J H.Effects of TGF-β3 on epithelial-mesenchymal transformation and epidermal growth factor receptor expression in palatogenesis of chicken embryo ［J］.Koean Cleft Lip Palate Assoc，2001，4:13-26.

［14］朱江輝，任愛國，郝玲，等.轉(zhuǎn)化生長因子β3基因多態(tài)性與唇腭裂關聯(lián)的核心家庭分析［J］.中國生育健康雜志，2009，20(6):346-351.

［15］林健燕，欒榮生，郭澤強，等.BMP4，TGF-β3基因多態(tài)性與環(huán)境暴露在非綜合征性唇腭裂發(fā)生中的交互作用［J］.中國口腔醫(yī)學雜志，2010，45(10):596-600.

［16］劉寧，劉嘉茵，崔毓桂，等.TGF-β3基因SfaNI多態(tài)性與非綜合性唇腭裂的遺傳易感性［J］.中華美容整形外科雜志，2008，19(2):152-155.

［17］Suazo J，Santos J，Scapoli L，et al.Association between TGF-B3 and non-syndromic cleft lip with or without cleft palate in a Chilean population［J］.Cleft Palate Craniofac J，2010，47(5):513-517.

［18］Marazita M L，Lidral A C，Murray J C，et al.Genome scan，fine-mapping，and candidate gene analysis of non-syndromic cleft lip with or without cleft palate reveals phenotype-specific differences in linkage and association results［J］.Hun Hered，2009，68(3):151-170.

［19］田曉菲，金先慶，羅慶，等.CTGF、TGFβ3及其受體在唇腭裂裂緣組織中的表達及意義［J］.重慶醫(yī)科大學學報，2009，34(1):55-58.

［20］Nogai H，Rosowski M，Grun J，et al.Follistatin antagonizes transforming growth factor-beta3-induced epithelial-mesenchymal transition in vitro:implications for murine palatal development supported by microarray analysis［J］.Differentiation，2008，76(4):404-416.

［21］Gan L Q，F(xiàn)u Y X.Liu X，et al.Transforming growth factor-B3 expression up-regulates on cleft palates induced by 2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in mice［J］.Toxicl and Ind Healyh，2009，25(7):473-478.

［22］柴茂洲，李承浩，何永紅，等.四氯二苯對二嚼英和地塞米松誘導小鼠腭裂及轉(zhuǎn)化生長因子-β3和受體活化樣激酶5的表達［J］.華西口腔醫(yī)學雜志，2010，28(4):356-360.