張 嵐，宋一民，張?jiān)茲h

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 河南鄭州 450052)

宮頸癌是嚴(yán)重危害婦女健康的常見惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例高達(dá)50余萬，我國每年新發(fā)宮頸癌14余萬例，占世界宮頸癌新發(fā)病例的28.8%［1］。宮頸癌的確切病因和發(fā)病機(jī)制目前雖不完全明確，但是自20世紀(jì)80年代初期，德國科學(xué)家zur Hausen等［2，3］首次從宮頸癌細(xì)胞中分離出人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)并提出HPV感染與宮頸癌的發(fā)生有密切關(guān)系這一見解之后，圍繞HPV感染與宮頸癌發(fā)生關(guān)系這一熱點(diǎn)課題，已取得了較大的研究進(jìn)展。HPV L1是HPV的主要衣殼蛋白，具有特異的抗原性，在宮頸癌的發(fā)展進(jìn)程中亦發(fā)揮著重要作用。

1 HPV感染與宮頸癌

1.1 HPV的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) HPV是微小、無包膜的環(huán)狀雙鏈DNA病毒，由72面的蛋白衣殼包裹，含有8000個(gè)堿基對(duì)(bp)。病毒的基因組按其功能可分為:早期基因區(qū)(E)、晚期基因區(qū)(L)及非編碼區(qū)(NCR)3個(gè)區(qū)。早期基因區(qū)全長(zhǎng)4 500 bp，編碼在E1，E2，E4，E5，E6，E7等6個(gè)與病毒復(fù)制和細(xì)胞轉(zhuǎn)化密切有關(guān)的蛋白中;晚期基因區(qū)全長(zhǎng)2 500 bp，由L1和L2組成，L1高度保守，L2高度可變，反映HPV抗原的多態(tài)性;非編碼區(qū)全長(zhǎng)1 000 bp，含有啟動(dòng)RNA合成的核苷酸序列從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在E1，E2，E4，E5，E6，E7等6個(gè)與病毒復(fù)制和細(xì)胞轉(zhuǎn)化密切有關(guān)的蛋白中，E6和E7為癌蛋白，是高危型HPV致癌的主要轉(zhuǎn)化基因，該類基因體外轉(zhuǎn)染某些細(xì)胞系后，可致使細(xì)胞永生化或惡變。HPV的E6和E7整合于宿主細(xì)胞基因組內(nèi)是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的關(guān)鍵因素［1，4］。

1.2 HPV的流行病學(xué)及分型 在zur Hausen提出HPV可引發(fā)宮頸癌觀點(diǎn)的啟示下，Walboomers對(duì)世界22個(gè)國家的1 035例宮頸癌標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HPV的檢出率高達(dá)99.7%，提示，HPV感染不僅在全球廣泛存在，而且進(jìn)一步證實(shí)HPV與宮頸癌的發(fā)生關(guān)系密切勿容質(zhì)疑［5］。到目前為止，已分離鑒定出100余種HPV，其中40種HPV可感染生殖系統(tǒng)［4］，主要通過皮膚和粘膜途徑感染［6］。根據(jù)HPV致癌能力的強(qiáng)弱不同，可將眾多類型的HPV分為高危型和低危型2類，HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82等被認(rèn)為是高危型HPV，其中HPV 16、18最重要; HPV 6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81等被認(rèn)為是低危型HPV，其中HPV 6、11最重要［7］。

1.3 HPV感染與宮頸癌的發(fā)生 流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在性生活活躍的婦女人群中，一生中都有可能感染HPV，但是，大多數(shù)免疫力正常的婦女在HPV感染后2年左右會(huì)自然緩解或轉(zhuǎn)為陰性，只有少數(shù)免疫力低下或HPV持續(xù)性感染者，才有可能導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及宮頸癌的發(fā)生［8］，表明HPV感染雖然與宮頸癌的發(fā)生密切有關(guān)，但不會(huì)導(dǎo)致免疫健全的宿主必然發(fā)生癌變，提示宮頸癌發(fā)生過程中除HPV感染外，還有其他協(xié)同因子發(fā)揮作用［9］。HPV感染是否引起CIN或?qū)m頸癌還與感染的HPV類型有關(guān)，感染高危型HPV的婦女，其宮頸癌的發(fā)病率比一般人群高300倍［10］。

1.4 HPV感染的致癌機(jī)理 雖然HPV感染是引發(fā)宮頸癌的重要因素，但是絕大部分感染者表現(xiàn)為亞臨床性或自限性感染，約90%的感染者可清除HPV而自愈，引起宮頸癌的幾率甚少。HPV感染后，一般常經(jīng)歷一個(gè)無癥狀的潛伏期，此時(shí)病毒基因組DNA在染色體外以游離形式存在。當(dāng)宿主免疫低下、病毒致病力較強(qiáng)或病毒持續(xù)感染時(shí)，病毒即開始大量復(fù)制。病毒復(fù)制的方式有兩種:一種是病毒DNA繼續(xù)以游離方式存在于細(xì)胞核內(nèi)，另一種是病毒DNA整合到宿主細(xì)胞核DNA中。前者一般引起宮頸良性病變或?qū)m頸癌前病變，只有當(dāng)HPV基因組DNA整合到宿主細(xì)胞核DNA中時(shí)，才給HPV的致癌提供了重要條件。

HPV基因組DNA整合到宿主細(xì)胞核DNA后，其致癌作用與E6和E7基因的作用密切有關(guān)。E6和E7基因是分別編碼為含150個(gè)和100個(gè)氨基酸的病毒原癌蛋白，是致癌型HPV的主要轉(zhuǎn)化基因。研究表明，HPV E6蛋白一方面可與腫瘤抑制基因產(chǎn)物P53蛋白相結(jié)合，通過P53的泛素化及蛋白水解，使P53喪失對(duì)腫瘤的抑制作用及轉(zhuǎn)錄性質(zhì)［11］;另一方面E6蛋白可作用于Paxillin蛋白及干擾素調(diào)節(jié)因子，進(jìn)而阻斷病毒對(duì)INF-β的誘導(dǎo)作用［12］;此外，E6蛋白還可使惡變的細(xì)胞對(duì)TNF-α介導(dǎo)的AP復(fù)合物的變化不產(chǎn)生反應(yīng)［13］。HPV E7蛋白是一種核蛋白，可與視網(wǎng)膜母細(xì)胞(retinoblast，Rb)基因蛋白相互作用，繼之從Rb基因復(fù)合物中釋放出EF2轉(zhuǎn)錄激活因子，在EF2作用下啟動(dòng)細(xì)胞周期相關(guān)基因的活化，使細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的分裂期［14］。因此，E6基因引起的p53降解和E7基因?qū)е碌腞b基因功能變化是HPV引發(fā)宮頸癌的核心致癌機(jī)理。Frega［15］對(duì)不同年齡組宮頸上皮內(nèi)瘤變的病人進(jìn)行E6/E7 mRNA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)E6/E7 mRNA檢測(cè)是預(yù)測(cè)HPV病毒活性是否有意義的生物學(xué)標(biāo)志，對(duì)30歲以上伴有細(xì)胞學(xué)異?；蛏掀?nèi)瘤變病人的預(yù)后判斷更有價(jià)值。

2 HPV L1殼蛋白與宮頸癌發(fā)生的關(guān)系及檢測(cè)意義

2.1 HPV L1殼蛋白的生物學(xué)特點(diǎn) HPV的晚期基因區(qū)(L)位于HPV DNA序列的下游，含有兩個(gè)開放閱讀框架。其中HPV L1編碼的HPV L1殼蛋白是HPV的主要衣殼蛋白，在所有類型的HPV中，HPV L1殼蛋白具有高度保守性的特點(diǎn);而HPV L2編碼的HPV L2蛋白是一個(gè)形體較小的衣殼蛋白，在不同類型的HPV中高度變異。HPV L1衣殼蛋白為對(duì)稱的20面體，直徑50～55 nm，由72個(gè)殼蛋白單位組成，其分子量約55 KD［16］。現(xiàn)已證明，L1殼蛋白是HPV復(fù)制早期的結(jié)構(gòu)蛋白［17］，在HPV的早期復(fù)制階段L1殼蛋白呈陽性表達(dá)，而當(dāng)HPV DNA整合到宿主細(xì)胞DNA后，L1殼蛋白則呈陰性反應(yīng)。HPV L1不僅可以自我組裝成具有良好抗原性和免疫原性的病毒樣顆粒(virus-like particle，VLP)，而且具有免疫細(xì)胞識(shí)別的表位，是免疫細(xì)胞殺傷HPV的攻擊位點(diǎn)，不僅是研究HPV疫苗的重要靶抗原，而且是反映宮頸病變程度及預(yù)測(cè)宮頸病變發(fā)展進(jìn)程的重要生物學(xué)標(biāo)志［18，19］。

2.2 HPV L1殼蛋白的檢測(cè)方法及判斷標(biāo)準(zhǔn) HPV L1殼蛋白是HPV感染復(fù)制早期的結(jié)構(gòu)蛋白，在HPV復(fù)制的早期階段呈陽性表達(dá)，當(dāng)HPV DNA整合到宿主細(xì)胞核DNA后則表達(dá)缺失而呈陰性表達(dá)［17］。由于宮頸鱗癌多經(jīng)過CIN而呈現(xiàn)多階段的發(fā)展模式，而HPV L1殼蛋白的檢測(cè)能預(yù)測(cè)HPV感染后CIN的發(fā)展及預(yù)后，可防止對(duì)某些CIN患者的過渡治療，因此HPV L1殼蛋白的檢測(cè)已受到廣泛的重視并應(yīng)用于臨床。

HPV L1殼蛋白檢測(cè)通常采用免疫組織/細(xì)胞化學(xué)方法［16］。最近美國愛迪旺公司推出的賽泰人乳頭瘤病毒L1蛋白檢測(cè)試劑盒，是以非同位素標(biāo)記核酸分子雜交技術(shù)和免疫組織/細(xì)胞化學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，同時(shí)在核酸水平和免疫水平雙重檢測(cè)HPV L1的方法，不僅可檢測(cè)HPV L1的殼蛋白表達(dá)，而且可檢測(cè)其DNA的表達(dá)。該技術(shù)可識(shí)別HPV16、18、31、48等與宮頸癌發(fā)生有關(guān)的多種HPV L1殼蛋白。由于HPV L1殼蛋白為核蛋白，只有當(dāng)胞核呈紅色時(shí)才是特異性染色，其他部位紅染均為非特異性染色。在視野中僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)胞核呈紅色著色即可診斷為HPV L1陽性［20，21］。為保證診斷的特異性，每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)立陽性對(duì)照(濕疣組織或細(xì)胞)和陰性對(duì)照(不加HPV抗體)［22］。

2.3 HPV L1殼蛋白檢測(cè)的價(jià)值及機(jī)理

2.3.1 HPV L1殼蛋白檢測(cè)的價(jià)值:20世紀(jì)90年代Mclean等發(fā)現(xiàn)，宮頸上皮內(nèi)瘤變的進(jìn)展程度與HPV L1蛋白的表達(dá)密切相關(guān)，HPV L1蛋白的表達(dá)可反映宮頸上皮內(nèi)瘤變的發(fā)展及預(yù)后［23］。此后，圍繞HPV L1殼蛋白檢測(cè)與HPV感染引發(fā)宮頸相關(guān)病變的關(guān)系進(jìn)行了大量的研究。研究表明，在宮頸上皮內(nèi)瘤變患者的細(xì)胞或組織中，隨著CIN級(jí)別的增加或病變的加重，HPV L1殼蛋白的表達(dá)依次降低，而在宮頸鱗癌組織或細(xì)胞中HPV L1殼蛋白呈陰性表達(dá)［16，20，23］。結(jié)果提示，HPV L1殼蛋白檢測(cè)不僅可了解HPV感染后機(jī)體的免疫狀況，又可作為宮頸病變預(yù)后的判斷指標(biāo)［23，24］。Rauber等對(duì)279例高危型HPV陽性CIN涂片中的HPV L1殼蛋白進(jìn)行檢測(cè)，并通過25個(gè)月的隨訪發(fā)現(xiàn):HPV L1陽性患者中49.1%自然消退，41.5%病變無明顯進(jìn)展，僅9.4%的病例其病變顯示進(jìn)展;而在HPV L1陰性患者中，33.3%自然消退，40.7%病變無明顯進(jìn)展，但是有25.9%的病例其病變顯示進(jìn)展［25］。Griesser等［26］的研究顯示，HPV L1殼蛋白的表達(dá)缺失主要出現(xiàn)在高危型HPV感染所致的重度CIN病例。以上研究均提示，HPV L1陰性患者更具有惡變發(fā)展的趨勢(shì)，應(yīng)對(duì)該類病人采取積極的治療以防止病變的惡化［20］。

對(duì)宮頸病變進(jìn)展及預(yù)后判斷的檢測(cè)，除HPV L1殼蛋白外，近年來提倡HPV L1與P16NK4a的聯(lián)合檢測(cè)。相關(guān)研究表明，在CIN病變中，HPV L1殼蛋白的陽性率隨病理分級(jí)的增高而逐漸降低，而P16NK4a的陽性率隨病理分級(jí)的增高而逐漸升高，HPV L1殼蛋白和P16NK4a均可作為宮頸病變程度和發(fā)展趨勢(shì)的預(yù)測(cè)指標(biāo)，當(dāng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)P16NK4a+/HPV L1-時(shí)，提示宮頸病變具有較高地惡變趨向［27－29］。Balan等［30］認(rèn)為，HPV L1、P16和COX2聯(lián)合檢測(cè)對(duì)預(yù)測(cè)宮頸上皮內(nèi)瘤變的發(fā)展進(jìn)程更有價(jià)值。

2.3.2 HPV L1殼蛋白表達(dá)預(yù)測(cè)宮頸病變進(jìn)展的機(jī)理:HPV感染首先侵犯鱗狀上皮的基底細(xì)胞，侵入基底細(xì)胞后立即脫去衣殼，HPV的環(huán)狀DNA進(jìn)入基底細(xì)胞的核內(nèi)，在核內(nèi)游離DNA的復(fù)制受到嚴(yán)格的控制并與宿主細(xì)胞的復(fù)制周期相一致。當(dāng)感染HPV的基底細(xì)胞逐漸分化并向表層移動(dòng)到鱗狀上皮中間層時(shí)，HPV DNA大量復(fù)制并產(chǎn)生大量HPV DNA拷貝。當(dāng)上皮進(jìn)一步分化達(dá)到中上層時(shí)，開始形成HPV L1殼蛋白。而HPV L1殼蛋白是公認(rèn)的免疫反應(yīng)攻擊HPV和受染細(xì)胞的主要位點(diǎn)，因此HPV L1殼蛋白在鱗狀上皮中上層形成后，即可通過機(jī)體的免疫監(jiān)視而抑制宮頸病變的進(jìn)展，此也是在HPV L1檢測(cè)時(shí)HPV L1陽性細(xì)胞主要位于鱗狀上皮中上層或表層的原因。相反，當(dāng)HPV進(jìn)入基底細(xì)胞后其DNA與胞核DNA整合后，則不能形成HPV L1殼蛋白，機(jī)體失去對(duì)病毒的免疫監(jiān)視，HPV L1殼蛋白呈陰性表達(dá)，提示宮頸病變具有向惡性發(fā)展的潛能［31］。

3 結(jié)語及展望

HPV雖然是導(dǎo)致宮頸癌的主要因素，但并非HPV感染后均引起宮頸的相關(guān)病變或癌癥，其中宿主的免疫狀況亦發(fā)揮重要的作用。HPV L1殼蛋白檢測(cè)不僅可預(yù)測(cè)HPV感染后宮頸病變的進(jìn)程及預(yù)后，而且通過檢測(cè)可制定正確的治療方案，避免對(duì)某些CIN患者的過度治療。此外，HPV L1殼蛋白具有明顯的抗原性并且是免疫細(xì)胞殺傷HPV的主要攻擊位點(diǎn)，以其作為靶抗原而制作的HPV預(yù)防性疫苗(Gardasil疫苗)已經(jīng)取得了巨大的成功［32］，雖然HPV的治療性疫苗正在探索研究之中，如能開發(fā)研制成功并投入臨床使用，通過HPV感染防治這條軸線對(duì)宮頸癌進(jìn)行系統(tǒng)性的研究將具有良好的前景。

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