郭翠翠綜述 李紅鋼 熊承良審校

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院計劃生育研究所、生殖醫(yī)學(xué)中心?？漆t(yī)院(武漢，430030)

近20年來人們在動物、植物及病毒等生物中發(fā)現(xiàn)了一系列小分子非編碼 RNA，包括 miRNA［1］、piRNA［2］和 siRNA［3］。與其相關(guān)的 Argonaut家族蛋白分為2個亞家族:Ago亞家族和Piwi亞家族。精子發(fā)生是指由精原細(xì)胞經(jīng)初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精細(xì)胞至成熟精子形成的過程。整個過程分為3個階段:精原細(xì)胞的增殖、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂和精子細(xì)胞的變態(tài)過程，這一復(fù)雜的過程受多種因素的調(diào)控。近年來，小RNA在精子發(fā)生中的作用越來越受到人們的重視，現(xiàn)將三種小分子非編碼RNA在精子發(fā)生中調(diào)控作用的研究現(xiàn)狀概述如下。

1 3種小分子非編碼RNA簡介

miRNA、piRNA和siRNA都是非編碼的小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及表觀遺傳水平等方面調(diào)控基因的表達(dá)，但它們之間也有區(qū)別:①miRNA和siRNA的長度介于20～25nt之間，而piRNA介于25～30nt之間;②miRNA和piRNA都是單鏈、內(nèi)源性小分子 RNA，而 siRNA為雙鏈、外源性小分子RNA;③miRNA和siRNA與Ago蛋白家族中的Ago亞家族蛋白相互結(jié)合，而piRNA與Ago蛋白家族中的Piwi亞家族蛋白相互結(jié)合;④miRNA和siRNA在動、植物的各種組織中基本都有表達(dá)，而piRNA的表達(dá)具有顯著的組織特異性，目前只在哺乳動物和模式生物，如果蠅的生殖腺細(xì)胞及部分干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn);⑤miRNA和siRNA的生成分別是由前體RNA通過核酸內(nèi)切酶Dicer1和Dicer2催化產(chǎn)生，但研究表明piRNA的產(chǎn)生過程沒有Dicer1或Dicer2的參與;⑥miRNA主要是對內(nèi)源性mRNA進(jìn)行修飾，對機體的生長發(fā)育起重要作用;piRNA的功能主要是維持基因組中轉(zhuǎn)座子的正常沉默狀態(tài)，以防止基因組中轉(zhuǎn)座子爆發(fā)而引起相應(yīng)基因的改變;siRNA主要是封閉和防御外源性DNA對細(xì)胞的入侵，如病毒產(chǎn)生的DNA片段，保護機體基因組免受轉(zhuǎn)座子的破壞和病毒感染，但不參與機體的生長發(fā)育［4］。

2 miRNA與精子發(fā)生

盡管miRNA在精子發(fā)生中的作用仍然是一個未知的領(lǐng)域，但研究表明哺乳動物的睪丸組織中含有大量的miRNA，如Yu等［5］比較小鼠在發(fā)育期前后睪丸組織中miRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-469、miR-34、miR-16和miR-122a等表達(dá)量隨睪丸發(fā)育逐漸增加;2007年Yan等［6］采用miRNA表達(dá)譜芯片掃描技術(shù)，通過比較未成年與成年小鼠睪丸組織，發(fā)現(xiàn)成年小鼠睪丸組織中有14種miRNA下調(diào)，5種上調(diào);2009年Yan等［7］又通過芯片和熒光定量PCR比較了未成年猴與成年猴、未成年猴與成年人睪丸組織，發(fā)現(xiàn)miRNA的表達(dá)隨著性成熟不斷增加;2010年Luo等［8］比較miRNA在豬性成熟前后睪丸組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)成年豬睪丸組織中有51種miRNA上調(diào)，78種下調(diào)。這些研究提示miRNA可能在精子發(fā)生中起到重要的調(diào)控作用，為精子發(fā)生機制的研究提供了一定的幫助。同時研究發(fā)現(xiàn)與miRNA相關(guān)的Dicer在精子分化中起重要作用，若敲除Dicer 1，長形精子細(xì)胞的形態(tài)和活力將會發(fā)生異常;在睪丸支持細(xì)胞中選擇性切除Dicer，可導(dǎo)致精子數(shù)目減少、睪丸功能退化，最終導(dǎo)致不育。近年來對于miRNA在精子發(fā)生中的調(diào)控機制也有了一些突破，如最近Yu等［5］研究證明miR-122a通過抑制轉(zhuǎn)錄蛋白2的表達(dá)，在減數(shù)分裂后的精子細(xì)胞中起調(diào)控作用;Novotny等［9］發(fā)現(xiàn) miR-17-5p在精子形成過程中不斷上調(diào)，通過抑制E2F1使生精細(xì)胞免受凋亡，利于正常精子的形成;miR-34c通過直接下調(diào)TGIF2和NOTCH2，從而在精子發(fā)生的晚期階段起調(diào)控作用［10］;miR-18通過作用于熱休克轉(zhuǎn)錄因子2，以利于精子發(fā)生的正常進(jìn)行［11］。由于miRNA進(jìn)化的高度保守性，因此上述miRNA及其調(diào)控機制有可能在人類精子細(xì)胞發(fā)生過程中也起到類似的作用。

3 piRNA與精子發(fā)生

piRNA僅在精子發(fā)生過程中的粗線期精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞中表達(dá)，表明其在精子發(fā)生過程中的減數(shù)分裂階段起重要的調(diào)控作用。小鼠有3種Piwi蛋白:miwi、miwi2和 mili，全部在睪丸中高表達(dá)，在精原干細(xì)胞的自我更新和精子細(xì)胞發(fā)育中是必不可少的［12］。mili和miwi蛋白出現(xiàn)在小鼠精子發(fā)生的不同階段:mili存在于從精原細(xì)胞到粗線期精母細(xì)胞發(fā)生階段的生殖細(xì)胞中，miwi則存在于從粗線期精母細(xì)胞到圓形精子細(xì)胞發(fā)生階段的生殖細(xì)胞中。任一個Piwi蛋白突變都會影響生殖細(xì)胞，導(dǎo)致DNA受損和生殖細(xì)胞的凋亡。在雄性小鼠中分別敲除miwi、miwi2和mili的純合子，會出現(xiàn)生精停滯、生殖細(xì)胞凋亡。但若分別敲除雌性小鼠的miwi、miwi2和mili純合子，其仍能產(chǎn)生正常后代，這一現(xiàn)象提示miwi、miwi2和mili似乎特異性作用于雄性生殖細(xì)胞。mili和miwi2的突變對減數(shù)分裂產(chǎn)生影響，而miwi的突變則影響生殖細(xì)胞的成熟。

最近研究發(fā)現(xiàn)磷脂酶D(MitoPLD)在piRNA的產(chǎn)生過程中起到重要作用，MitoPLD突變的雄性小鼠表現(xiàn)為精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂停滯，去甲基化和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子去抑制狀態(tài)［13］。與Piwi蛋白相關(guān)的MOV10L1(RNA解螺旋酶)優(yōu)先表達(dá)于粗線期精母細(xì)胞中，在維持轉(zhuǎn)座子沉默和piRNA的產(chǎn)生中起重要作用，是維持精子發(fā)生和雄性生育力必不可少的重要成員［14，15］。此外，研究表明 Nct1和 Nct2是piRNA的前體物質(zhì)，主要表達(dá)于粗線期精母細(xì)胞［16］。Gu等［17］通過對 490 例原發(fā)性無精子或少精子癥患者與468例正常生育力男性比較發(fā)現(xiàn)，Piwi基因的遺傳多態(tài)性也會導(dǎo)致精子發(fā)生缺陷。

4 siRNA與精子發(fā)生

siRNA引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象即RNA干擾，它廣泛存在于生物體內(nèi)，是生命基因表達(dá)和生長發(fā)育的重要調(diào)控手段。在精子發(fā)生的早期階段，利用siRNA沉默Gfra1基因，小鼠精原干細(xì)胞將會從自我更新轉(zhuǎn)變?yōu)橄蚓?xì)胞分化，利用siRNA敲除Nodal基因?qū)?dǎo)致細(xì)胞大量凋亡和小鼠精原干細(xì)胞分化減少;在精子發(fā)生的晚期階段，通過siRNA特異性敲除Slx和SlxL1基因，使Slx和SlxL1蛋白減少，小鼠生育力明顯下降［18］。在支持細(xì)胞中，利用siRNA敲除Pard6a或Par3基因，將導(dǎo)致血睪屏障相關(guān)蛋白表達(dá)大量減少［19］，而siRNA對beta-1整聯(lián)蛋白的抑制，會導(dǎo)致支持細(xì)胞-支持細(xì)胞界面上閉鎖蛋白的再分配和血睪屏障的失衡［20］。siRNA還可用于沉默Bcl6b、Erm和Lhx1基因的轉(zhuǎn)錄，而研究證實這些轉(zhuǎn)錄因子在體外精原干細(xì)胞自我更新中起到重要調(diào)控作用［21］。

5 小RNA的應(yīng)用前景

由于miRNA和piRNA在精子發(fā)生中起重要調(diào)控作用，一些miRNA和piRNA特異表達(dá)于睪丸組織，在其他組織中不存在，更重要的是piRNA僅表達(dá)于精子發(fā)生的中晚期階段，其表達(dá)不僅具有時序特異性，還具有細(xì)胞特異性，這就為避孕研究提供了生物學(xué)基礎(chǔ)，其抑制劑可能用于男性避孕。而對Dicer依賴的調(diào)控方式在哺乳動物生殖功能中的作用分析，可為臨床上對不孕的研究和治療打開嶄新的思路。

使用siRNA的RNA干擾技術(shù)在探索精子發(fā)生調(diào)控中特異基因的功能是極其有效的，主要有3方面的應(yīng)用:①基礎(chǔ)研究，以進(jìn)一步檢測在精子發(fā)生調(diào)控中起重要作用的基因;②男性避孕，RNA干擾可以作為男性避孕的一種新型的有效工具，可以通過直接注入睪丸siRNA或shRNA來敲除與精子發(fā)生密切相關(guān)的基因，從而實現(xiàn)男性避孕;③男性不育的基因治療，通過沉默與疾病相關(guān)的基因來達(dá)到治療的目的。綜上所述，miRNA、piRNA和siRNA等小分子RNA的發(fā)現(xiàn)是RNA研究領(lǐng)域的一項重大突破，揭示了非編碼區(qū)新的重要調(diào)節(jié)機制，隨著研究的不斷展開和深入，miRNA、piRNA和siRNA還可能成為男性生殖系統(tǒng)疾病診斷和預(yù)后分析的新型生物學(xué)標(biāo)記，或者模擬其作用進(jìn)行新藥研發(fā)，為采用小分子干預(yù)生殖調(diào)節(jié)、治療生殖相關(guān)疾病提供新策略。

1 Lee RC，F(xiàn)einbaum RL，Ambros V，et al．elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14［J］．Cell，1993，75(5):843-854．

2 Girard A，Sachidanandam R，Hannon GJ，et a1．A germline-spe-cific class of small RNAs binds mammalian Piwi proleins［J］．Nature，2006，442(7099):199-202．

3 Plasterk RH．RNA silencing:the genome＇s immune system［J］．Science，2002，296(5571):1263-1265．

4 He Z，Kokkinaki M，Pant D，et al．Small RNA molecules in the regulation of spermatogenesis［J］．Reproduction，2009，137(6):901-911．

5 Yu Z，Raabe T，Hecht NB．MicroRNA Mirn122a reduces expression of the posttranscriptionally regulated germ cell transition protein 2(Tnp2)messenger RNA(mRNA)by mRNA cleavage［J］．Biol Reprod，2005，73(3):427-433．

6 Yan N，Lu Y，Sun H，et al．A microarray for microRNA profiling in mouse testis tissues［J］．Reproduction，2007，134(1):73-79．

7 Yan N，Lu Y，Sun H，et al．Microarray profiling of microRNAs expressed in testis tissues of developing primates［J］．J Assist Reprod Genet，2009，26(4):179-186．

8 Luo L，Ye L，Liu G，et al．Microarray-based approach identifies differentially expressed microRNAs in porcine sexually immature and mature testes［J］．PLoSOne，2010，5(8):e11744．

9 Novotny GW，Sonne SB，Nielsen JE，et al．Translational repression of E2F1 mRNA in carcinoma in situ and normal testis correlates with expression of the miR-17-92 cluster［J］．Cell Death Differ，2007，14(4):879-882．

10 Bouhallier F，Allioli N，Lavial F，et al．Role of miR-34c microRNA in the late steps of spermatogenesis［J］．RNA，2010，16(4):720-731．

11 Bj?rk JK，Sandqvist A，Elsing AN，et al．miR-18，a member of Oncomir-1，targets heat shock transcription factor 2 in spermatogenesis［J］．Development，2010，137(19):3177-3184．

12 Klattenhoff C，Theurkauf W．Biogenesis and germline functions of piRNAs［J］．Development，2008，135(1):3-9．

13 Watanabe T，Chuma S，Yamamoto Y，et al．MITOPLD is a mitochondrial protein essential for nuage formation and piRNA biogenesis in the mouse germline［J］．Dev Cell，2011，20(3):364-375．

14 Frost RJ，Hamra FK，Richardson JA，et a1．MOV10L1 is necessary for protection of spermatocytes against retrotransposons by Piwi-interacting RNAs［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107(26):11847-11852．

15 Zheng K，Xiol J，Reuter M，et a1．Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA(piRNA)pathway［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107(26):11841-11846．

16 Xu M，You Y，Hunsicker P，et al．Mice deficient for a small cluster of Piwi-interacting RNAs implicate Piwi-interacting RNAs in transposon control［J］．Biol Reprod，2008，79(1):51-57．

17 Gu A，Ji G，Shi X，et a1．Genetic variants in Piwi-interacting RNA pathway genes confer susceptibility to spermatogenic failure in a Chinese population［J］．Hum Reprod，2010，25(12):2955-2961．

18 Cocquet J，Ellis PJ，Yamauchi Y，et al．Deficiency in the multicopy Sycp3-like X-linked genes Slx and Slxl1 causes major defects in spermatid differentiation［J］．Mol Biol Cell，2010，21(20):3497-3505．

19 Wong EW，Mruk DD，Lee WM，et al．Par3/Par6 polarity complex coordinates apical ectoplasmic specialization and blood-testis barrier restructuring during spermatogenesis［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(28):9657-9662．

20 Yan HH，Mruk DD，Wong EW，et al．An autocrine axis in the testis that coordinates spermiation and blood-testis barrier restructuring during spermatogenesis［J］．Proc Natl Acad Sci U SA，2008，105(26):8950-8955．

21 Oatley JM，Avarbock MR，Brinster RL．Glial cell line-derived neurotrophic factor regulation of genes essential for self-renewal of mouse spermatogonial stem cells is dependent on Src family kinase signaling［J］．JBiol Chem，2007 ，282(35):25842-25851．