王鳳羽 馬林先 李聰敏 常明秀 豐慧根 張金枝 孟 麗 王玉偉 劉治佑

1.河南省人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，河南省出生缺陷干預(yù)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(鄭州，450002);2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系;3.河南省胸科醫(yī)院

先天性心臟病(CHD)是胚胎在發(fā)育過(guò)程中由于心臟、血管發(fā)育障礙所致的心臟血管形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能、代謝上的異常［1］。22q11.2微缺失綜合征是迄今為止少數(shù)已明確的CHD病因之一。22q11微缺失區(qū)域位于 D22S427/1638和 D22S306/308之間，大小為1.5～3 Mb。目前普遍認(rèn)為，缺失發(fā)生的原因是染色體減數(shù)分裂后重組時(shí)出現(xiàn)不對(duì)稱(chēng)和異常。Saita等［2］對(duì)20個(gè)DGS/VCFS家系22q11.2區(qū)域的3Mb片斷進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單倍體重組時(shí)同源染色體近端內(nèi)部交換現(xiàn)象極為普遍。此外，22q11區(qū)域的低重復(fù)拷貝序列(LCRs)間錯(cuò)誤結(jié)合也可導(dǎo)致一對(duì)染色體重排，其中一條發(fā)生缺失。本研究運(yùn)用多重鏈接依賴(lài)式探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)對(duì)CHD患兒進(jìn)行22q11微缺失檢測(cè)，了解其在CHD患兒中的發(fā)生情況，探討 MLPA用于臨床診斷22q11微缺失的應(yīng)用價(jià)值，為CHD的優(yōu)生咨詢(xún)和產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)選取2010年6月～2011年5月河南省胸科醫(yī)院小兒心胸外科CHD患兒120例為研究對(duì)象。其中男性58例，女性62例;年齡6個(gè)月～12歲;相互之間均無(wú)親緣關(guān)系。所有病例均經(jīng)臨床、心臟彩超、手術(shù)確診，且采用細(xì)胞培養(yǎng)的方法進(jìn)行染色體核型分析，未發(fā)現(xiàn)異常。本研究標(biāo)本使用均得到患兒家屬知情并同意。60例無(wú)CHD家族史的河南漢族正常兒童作為正常對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取與檢測(cè) 用醋酸鉀沉淀蛋白質(zhì)，異丙醇沉淀基因組DNA，TE溶解。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度及質(zhì)量，A260/A280=1.8，A260/A230＞2，TE 溶液稀釋至 50ng/μl的終濃度，－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 MLPA檢測(cè) 采用荷蘭 MRC－Holland公司生產(chǎn)的MLPA P250試劑盒，共48個(gè)探針，其中29個(gè)位于22q11上，其余19個(gè)位于22q11以外，作為對(duì)照探針。22q11.2 LCR缺失核心區(qū)域探針共24個(gè)，分布見(jiàn)圖1。所有的反應(yīng)在熱蓋溫度為105℃的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀上進(jìn)行。

圖1 22q11.2 LCR A－G區(qū)域的大小及探針?lè)植记闆r

1.2.3 多重探針雜交 取待測(cè)DNA 150ng置于PCR管中，加H2O 至5μl，于PCR 儀上98℃變性5min，快速降溫，25℃ 維持。取出PCR管，加入多重探針及MLPA 緩沖液各 1.5μl，充分混勻后，95℃ 變性1min，60℃雜交 16h，54℃維持。

1.2.4 多重探針鏈接 在上述PCR管內(nèi)加入鏈接酶1μl及連接酶緩沖液 A、B各3μl，再加入 H2O 25μl。配成40μl反應(yīng)體系，54℃ 反應(yīng) 15min，隨后98℃ 5min滅活鏈接酶。

1.2.5 多重PCR反應(yīng) 取上述鏈接產(chǎn)物10μl，分別加入4μl SALSA PCR 緩沖液、26μl H2O，配成 40μl反應(yīng)體系進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 60s，35 個(gè)循環(huán)。72℃ 延伸 20min，15℃維持。

1.3 毛細(xì)管電泳檢測(cè)

取2μl PCR 產(chǎn)物，分別加入32μl SLS，0.3μl D1maker，混勻，利用遺傳分析儀(BECKMAN CEQ 8800)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳和采集數(shù)據(jù)。

1.4 MLPA產(chǎn)物分析及結(jié)果判定

將CEQ System分析后的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為Excel格式，所得數(shù)據(jù)通過(guò)Coffalyser v9.4軟件(Holland－MRC公司)進(jìn)行分析，得出基因相對(duì)拷貝數(shù)比值。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，0.3﹤比值﹤0.7，表示該探針?biāo)鶛z測(cè)基因片段存在雜合缺失;0.7﹤比值﹤1.3，表示該基因片段無(wú)缺失;0﹤比值﹤0.3，表示該探針檢測(cè)的片段純合子缺失;比值﹥1.3表示該檢測(cè)區(qū)域存在重復(fù)片段。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

本次研究的120例CHD患兒中，室間隔缺損占35.8%(43/120)，法洛四聯(lián)癥占 19.2%(23/120)，房間隔缺損占10%(12/120)。另外還有房室間隔缺損，室間隔缺損伴卵圓孔未閉，室間隔缺損伴肺動(dòng)脈狹窄等其它復(fù)合類(lèi)型。

2.2 檢測(cè)結(jié)果

120例CHD患兒中，檢出22q11缺失10例，占8.33%;檢出 22q11重復(fù) 1例，占 0.83%;剩余 109例患兒未檢測(cè)到異常，占90.84%。所有陽(yáng)性標(biāo)本均進(jìn)行了3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果一致。見(jiàn)圖2，表1。10例22q11缺失中，3Mb缺失9例，2Mb缺失1例，包括室間隔缺損3例，法洛四聯(lián)癥5例，肺動(dòng)脈狹窄1例，右室雙出口1例。另外，檢測(cè)到小片段重復(fù)1例，CHD類(lèi)型為肺動(dòng)脈狹窄。見(jiàn)表2。

圖2 MLPA P250試劑盒檢測(cè)結(jié)果

表1 MLPA陽(yáng)性病例的基因相對(duì)拷貝數(shù)比值

3 討論

CHD占據(jù)了出生缺陷疾病的1/3，WHO統(tǒng)計(jì)資料顯示，全球每年約有150萬(wàn)兒童出生時(shí)患DHD，在足月和活產(chǎn)的新生兒中CHD的發(fā)病率為4‰～8‰，在早產(chǎn)兒、死產(chǎn)或流產(chǎn)病例中發(fā)病率更高［3］。我國(guó)CHD患病率為2.24‰ ～13.8‰，較嚴(yán)重的CHD多伴有心外畸形及多種功能障礙，如腭裂、唇裂、免疫功能下降、語(yǔ)言障礙、身體和智力發(fā)育不良等。CHD患病率居高不下，已成為影響兒童身心健康及人口生存質(zhì)量的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，給社會(huì)和家庭造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和精神等方面的負(fù)擔(dān)。因此，研究CHD的病因，進(jìn)一步開(kāi)展CHD的優(yōu)生咨詢(xún)和產(chǎn)前診斷具有重要意義。

本研究應(yīng)用MLPA，對(duì)120例不同表型的CHD患兒進(jìn)行22q11微缺失檢測(cè)，結(jié)果顯示，120例CHD患兒中22q11微缺失10例(8.33%)，涉及的CHD類(lèi)型多樣，其中室間隔缺損3例，法洛四聯(lián)癥5例，肺動(dòng)脈狹窄1例，右室雙出口1例。此外，還檢測(cè)出1例22q11重復(fù)(0.83%)，其表型為肺動(dòng)脈狹窄。

表2 MLPA檢測(cè)異常者的臨床資料及檢測(cè)結(jié)果

22q11.2微缺失在CHD中的比率約為5% ～12%，最常見(jiàn)的表現(xiàn)為室間隔缺損和動(dòng)脈導(dǎo)管未閉，房間隔缺損也很常見(jiàn)［4，5］，這與本研究結(jié)果 8.33%基本一致。檢測(cè)22q11微缺失的方法有很多。最早用染色體核型分析的方法進(jìn)行診斷，但檢出率較低。熒光原位雜交(FISH)方法既有分子雜交的高度特異性和敏感性，又能在染色體原位顯色，定位準(zhǔn)確，結(jié)果穩(wěn)定。但由于DNA探針的高度特異性，不屬于DNA探針?lè)秶畠?nèi)的缺失可能會(huì)漏診。此外耗時(shí)、昂貴等缺點(diǎn)使FISH檢測(cè)在遺傳學(xué)研究和臨床診斷應(yīng)用上受到一定限制。多重 PCR技術(shù)，即利用22q11區(qū)域的微衛(wèi)星標(biāo)記，進(jìn)行22q11微缺失檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)82%的病例有不同的微衛(wèi)星位點(diǎn)雜合性缺失［6］。該方法方便，成本低，檢測(cè)時(shí)間短且比較可靠。但是，該方法必須要有父母的DNA樣品做對(duì)照，并且對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物為單一條帶者，難以判別是否存在缺失。有時(shí)還必須選取更多的微衛(wèi)星標(biāo)記，增加成本和工作量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)出22q11微缺失結(jié)果與 FISH的符和率達(dá)99.7%［7］。該技術(shù)快速，方便，但不能檢測(cè)出染色體的嵌合現(xiàn)象和染色體的平衡易位。

MLPA是2002年由荷蘭的Schouten等設(shè)計(jì)發(fā)明的，僅需50～200ng DNA，能在同一反應(yīng)管中對(duì)40多個(gè)不同的待測(cè)核酸靶序列進(jìn)行定性和半定量分析。其原理是:針對(duì)不同的目的基因序列分別設(shè)計(jì)一對(duì)上下游探針，若待測(cè)DNA樣本中含有正常序列，上下游探針則可與其互補(bǔ)結(jié)合并通過(guò)鏈接酶鏈接成一條完整的探針，作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng);若目的基因有缺失，兩條探針則不能鏈接，因而形成的模板減少，相應(yīng)終產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳峰高降低或峰面積減小;反之，目的基因有重復(fù)時(shí)則導(dǎo)致毛細(xì)管電泳峰高上升或峰面積增大。所以通過(guò)終產(chǎn)物電泳峰高或峰面積的變化可判定是否存在基因缺失或重復(fù)，如連續(xù)多個(gè)基因發(fā)生缺失或重復(fù)，則可判定為基因片段缺失或重復(fù)［8］。

通過(guò)對(duì)120例樣本的檢測(cè)，筆者體會(huì)到高密度探針MLPA檢測(cè)染色體微缺失具有多種優(yōu)勢(shì):①能精確定位缺失片段及判定其大小;②對(duì)FISH不能檢測(cè)的遠(yuǎn)端缺失或重復(fù)有較強(qiáng)的檢測(cè)能力;③設(shè)立的對(duì)照位點(diǎn)多，使結(jié)果更加可靠;④MLPA檢測(cè)具有快速、價(jià)廉、自動(dòng)化等特點(diǎn)。然而本方法也存在一些缺陷，由于變性不完全，鹽離子濃度過(guò)高導(dǎo)致本研究中有2個(gè)樣本需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。延長(zhǎng)變性時(shí)間使變性更充分;用去離子水洗脫DNA降低離子濃度;對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器和耗材嚴(yán)格消毒等手段可以增加實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和成功率。另外發(fā)現(xiàn)，分析數(shù)據(jù)中存在個(gè)別染色體基因相對(duì)拷貝數(shù)比值低于設(shè)定范圍的現(xiàn)象，可能是受實(shí)驗(yàn)室條件影響，有待進(jìn)一步分析，以便優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，確保結(jié)果的真實(shí)性。

大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，凡是 CHD患者均應(yīng)進(jìn)行22q11微缺失檢測(cè)。因?yàn)閷?duì)于患有染色體22q11微缺失的人來(lái)說(shuō)，無(wú)論臨床表現(xiàn)有否和輕重如何，都有一半幾率將致病基因遺傳給后代，而且通常也會(huì)伴有其他方面的缺陷。因此，如果發(fā)現(xiàn)患兒有22q11微缺失時(shí)，應(yīng)對(duì)其父母進(jìn)行同樣檢測(cè)，以便為他們生育第二胎提供遺傳咨詢(xún)，以有效避免有嚴(yán)重綜合征的患兒出生。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)22q11微缺失的研究主要著眼于出生以后的人群，而產(chǎn)前診斷方面的報(bào)道鮮見(jiàn)。因此，建立22q11微缺失的產(chǎn)前診斷和二級(jí)干預(yù)已是當(dāng)務(wù)之急。MLPA是一種所需樣本少，高通量，相對(duì)價(jià)廉、快速的檢測(cè)方法，具有精確的定位功能，在CHD 22q11微缺失的基因診斷以及產(chǎn)前診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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