張世陽(yáng)，高海青

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院老年病科，合肥230001;2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院老年病科、山東省心血管病蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

人類(lèi)基因組工作框架圖的完成，標(biāo)志著生命科學(xué)的研究進(jìn)入后基因組時(shí)代。研究的重點(diǎn)從作為遺傳信息的載體—基因，逐漸轉(zhuǎn)向生理活動(dòng)的執(zhí)行者—蛋白質(zhì)。人們認(rèn)識(shí)到，只有對(duì)蛋白質(zhì)的數(shù)量、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、相互關(guān)系以及其生物功能的全面了解，才能闡明生命活動(dòng)的規(guī)律，揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)這一新興學(xué)科應(yīng)運(yùn)而生［1］。糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病(DM)最常見(jiàn)與最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是目前世界范圍內(nèi)主要致盲原因之一。蛋白質(zhì)組學(xué)的興起為DR的研究提供了嶄新的途徑，可以幫助闡明DR的發(fā)病機(jī)制、篩選特異性生物標(biāo)志物與尋找藥物靶標(biāo)等。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)在DR的研究中越來(lái)越受到重視。

1 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)的概念

1994 年澳大利亞學(xué)者 Wilkins與 Williams［2］首先提出了蛋白質(zhì)組(proteome)的概念。這是由英文蛋白質(zhì)(protein)與基因組(genome)組合而成的新的英文名詞。自此之后，蛋白質(zhì)組成為生命科學(xué)研究的新領(lǐng)域。

蛋白質(zhì)組是指一個(gè)細(xì)胞或組織基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)則為一衍生概念，是從整體的角度分析細(xì)胞或組織的動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平、翻譯后修飾狀態(tài)以及蛋白質(zhì)之間的相互作用，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)的規(guī)律，進(jìn)而了解疾病的發(fā)生與發(fā)展。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容

目前蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容主要分為兩部分，一是表達(dá)蛋白質(zhì)學(xué)，為“竭澤法”，即采用高通量的蛋白質(zhì)組研究技術(shù)分析生物體內(nèi)盡可能多乃至接近所有的蛋白質(zhì)。如我國(guó)科學(xué)家團(tuán)隊(duì)于2002年率先組織實(shí)施的“人類(lèi)肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃”。這種蛋白質(zhì)表達(dá)法研究大規(guī)?；⑾到y(tǒng)化，理論上符合蛋白質(zhì)組學(xué)的本質(zhì)，但實(shí)際操作中由于蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)往往比較困難。二是差異蛋白質(zhì)學(xué)，為“功能法”，即研究不同時(shí)間與空間下細(xì)胞蛋白質(zhì)組成的變化，以發(fā)現(xiàn)有差異的蛋白質(zhì)組學(xué)種類(lèi)為主要目標(biāo)，其特點(diǎn)在于其更高的可行性，并且反映了蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)本質(zhì)，因此具有廣泛和明確的應(yīng)用前景。近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究范圍也在不斷的完整與補(bǔ)充，如修飾蛋白質(zhì)學(xué)、定量蛋白質(zhì)學(xué)等。

3 糖尿病視網(wǎng)膜病變的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

DR是DM最為常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，是目前主要致盲眼病之一。資料顯示［3］，我國(guó)DM患者中DR患病率為25.2%，而且初次診斷的2型DM患者中DR患病高達(dá)12.4%。傳統(tǒng)的研究手段已經(jīng)初步揭示了DR的病因與發(fā)病機(jī)制，但仍缺乏對(duì)其復(fù)雜的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，限制了DR診治水平的提高。蛋白質(zhì)組學(xué)的興起為探討DR的病理生理機(jī)制以及新藥開(kāi)發(fā)提供了廣闊的平臺(tái)，為DR的臨床診治上帶來(lái)嶄新的視角與手段。目前蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)應(yīng)用于DR病變這一領(lǐng)域并取得一定的成果。

3.1 蛋白質(zhì)組學(xué)在DR相關(guān)的體外培養(yǎng)細(xì)胞的應(yīng)用 人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)的遷移、去分化以及增殖在DR病變中具有重要作用，成為近年來(lái)研究DR等眼底病變的切入點(diǎn)之一。West等［4］將人RPE細(xì)胞制備成亞細(xì)胞標(biāo)本，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)首次對(duì)人RPE細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，共分離檢測(cè)得到278種蛋白質(zhì)，大部分為管家蛋白，另外包括細(xì)胞視黃醛結(jié)合蛋白、細(xì)胞視黃醛連接蛋白、光間受體視黃類(lèi)結(jié)合蛋白等以及與視覺(jué)功能相關(guān)的蛋白。Alge等［5］運(yùn)用2-DE/MS研究了自然分化的RPE細(xì)胞以及體外培養(yǎng)去分化的RPE細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示在培養(yǎng)的去分化RPE細(xì)胞中吞噬功能蛋白如網(wǎng)格蛋白、組織蛋白酶D等并未變化，但與細(xì)胞形狀等形成蛋白如細(xì)胞角蛋白19、肌動(dòng)蛋白以及肌凝蛋白表達(dá)上調(diào)，與細(xì)胞增殖有關(guān)蛋白如翻譯起始因子、鈣依賴(lài)蛋白也有所上調(diào)，而與RPE細(xì)胞視覺(jué)功能相關(guān)蛋白如細(xì)胞視黃醛結(jié)合蛋白、細(xì)胞視黃醛連接蛋白表達(dá)則明顯下調(diào)，提示RPE細(xì)胞的體外去分化可能觸動(dòng)了視網(wǎng)膜病變的發(fā)生。在直接研究DM患者RPE蛋白質(zhì)組學(xué)上，新近有學(xué)者作了有益的嘗試。Decanini等［6］分離了無(wú) DR臨床癥狀的DM患者的RPE細(xì)胞，應(yīng)用2-DE聯(lián)合MALDI-TOF/MS技術(shù)，并與年齡匹配捐助眼來(lái)源RPE細(xì)胞比較，共發(fā)現(xiàn)31種差異蛋白質(zhì)，鑒定出18個(gè)差異蛋白，其中15個(gè)表達(dá)上調(diào)，3個(gè)表達(dá)下調(diào)。差異蛋白功能主要涉及能量代謝與伴侶蛋白，另外包括有脂質(zhì)氧化、細(xì)胞骨架、視網(wǎng)膜代謝以及運(yùn)輸合成蛋白等，考慮到RPE細(xì)胞在視網(wǎng)膜疾病中的重要性，該實(shí)驗(yàn)結(jié)論有助于進(jìn)一步探索與揭示早期DR的病理機(jī)制。

3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)在DR動(dòng)物模型中的應(yīng)用

3.2.1 DR 動(dòng)物模型蛋白質(zhì)組的變化 Liu 等［7］使用2-DE技術(shù)比較了8周DM大鼠視網(wǎng)膜與正常SD大鼠視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)的變化，共檢測(cè)出DM大鼠視網(wǎng)膜36個(gè)差異蛋白，其中5個(gè)蛋白上調(diào)，23個(gè)下調(diào)，8個(gè)點(diǎn)消失。盡管作者未運(yùn)用具體的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步探索，仍為國(guó)內(nèi)開(kāi)展蛋白質(zhì)組學(xué)在DR中的研究作出了努力。王亞冬等［8］用高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲菌素(STZ)腹腔注射建立大鼠2型DM模型，利用2-DE技術(shù)分離DM視網(wǎng)膜，與正常組比較，表達(dá)明顯差異的約150個(gè)蛋白質(zhì)，上調(diào)點(diǎn)68個(gè)，下調(diào)點(diǎn)82個(gè)。他們進(jìn)一步應(yīng)用 MALDITOF/MS與串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)鑒定發(fā)現(xiàn)10個(gè)為新發(fā)現(xiàn)蛋白，其功能涉及糖脂代謝、炎性反應(yīng)、NO合成酶途徑以及細(xì)胞骨架蛋白與分子伴侶蛋白等，隨后采用蛋白印跡技術(shù)驗(yàn)證了其中αA晶體蛋白，提示其在DM視網(wǎng)膜上明顯表達(dá)上調(diào)。

3.2.2 藥物干預(yù)對(duì)DR動(dòng)物模型蛋白質(zhì)組的影響目前觀點(diǎn)認(rèn)為［9］，差異表達(dá)的蛋白很有可能參與了DR的發(fā)生發(fā)展，而應(yīng)用藥物干預(yù)后能夠回調(diào)的蛋白則具有巨大的臨床實(shí)用價(jià)值，可以作為DR的分子標(biāo)記，以及作為今后治療和設(shè)計(jì)更為有效的藥物靶標(biāo)。國(guó)內(nèi)高海青課題組率先開(kāi)展了此方面研究，并取得了重大成果。他們選擇天然藥物葡萄籽原花青素提取物(GSPE)治療DM大鼠并進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與DM模型組比較，GSPE干預(yù)組7個(gè)蛋白回調(diào)至正常水平，分別是αB-晶狀體蛋白、βA4-晶狀體蛋白、αA-晶狀體蛋白、泛素羧基末端水解酶-L1、G蛋白-β1、IgG-2A與丙酮酸激酶。該研究提示晶狀體蛋白的高表達(dá)參與了DR的發(fā)生與發(fā)展，GSPE干預(yù)的抑制作用可能減緩DR的進(jìn)展;而泛素羧基末端水解酶-L1、G 蛋白-β1、IgG-2A與丙酮酸激酶在DM視網(wǎng)膜表達(dá)下調(diào)，其功能涉及細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖、跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化應(yīng)激等，GSPE干預(yù)的恢復(fù)作用有助于 DR的改善［10］。Gao等［11］應(yīng)用血管緊張素受體Ⅰ拮抗劑坎地沙坦干預(yù)STZ誘導(dǎo)建立的DM小鼠模型，利用LC-MS/MS技術(shù)比較干預(yù)前后蛋白質(zhì)組學(xué)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與非DM組比較，DM小鼠視網(wǎng)膜組有65個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生2倍以上的改變，其中的72%經(jīng)過(guò)坎地沙坦干預(yù)后可以回調(diào)。這些蛋白與代謝、氧化應(yīng)激以及凋亡等功能有關(guān)，并可能參與DR的發(fā)展，而血管緊張素受體Ⅰ拮抗劑坎地沙坦可能有助于DR的治療。胰島素是治療糖尿病的重要藥物之一，研究胰島素治療前后蛋白質(zhì)組的變化有利于真實(shí)世界中從蛋白質(zhì)水平上深入理解DR的病理生理機(jī)制。新近VanGuider等［12］同時(shí)采用多種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)(抗體Luminex、DIGE與 LS-MS/iTRAQ)研究 DM 大鼠視網(wǎng)膜病變蛋白質(zhì)的變化，并使用胰島素干預(yù)，結(jié)果提示，干預(yù)后地西泮結(jié)合抑制蛋白、膜聯(lián)蛋白5等蛋白恢復(fù)正常，而血漿銅藍(lán)蛋白、晶狀體蛋白β3、可溶性半乳糖苷結(jié)合凝集素3以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3等蛋白部分恢復(fù)正常，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2與晶狀體蛋白β2的上調(diào)則未受任何影響。作者認(rèn)為，胰島素干預(yù)后未能回調(diào)至正常的蛋白可能在DR發(fā)病機(jī)制的“代謝記憶”中發(fā)揮作用，并為DR的治療藥物的選擇提供了全新思路。

3.3 蛋白質(zhì)組學(xué)在DR患者中的應(yīng)用

3.3.1 DR患者玻璃體液蛋白質(zhì)組研究 玻璃體與視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)密切，眼底視網(wǎng)膜的病變往往反應(yīng)于玻璃體液的改變，同時(shí)玻璃體液的取材技術(shù)方便，目前玻璃體液成為了研究DR患者蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究對(duì)象。

Bresgen等［13］開(kāi)始利用2-DE分析增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)患者的玻璃體蛋白成分與正常人玻璃體以及血清蛋白的不同。研究結(jié)果顯示，正常的玻璃體內(nèi)最常見(jiàn)的蛋白質(zhì)為白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、α1-抗胰蛋白酶、免疫球蛋白與前清蛋白等。PDR玻璃體樣本中，轉(zhuǎn)鐵蛋白、α1-抗胰蛋白酶與前清蛋白的含量下降，而免疫球蛋白水平升高，更類(lèi)似于血清蛋白的構(gòu)成，提示PDR已經(jīng)發(fā)生血-視網(wǎng)膜屏障的破壞。另外，新發(fā)現(xiàn)3種低分子量蛋白只出現(xiàn)在PDR玻璃體中，分析可能為玻璃體視網(wǎng)膜的增生反應(yīng)導(dǎo)致的局部蛋白質(zhì)的異常額外合成。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步與完善，DR的功能蛋白質(zhì)組也有了更多的發(fā)現(xiàn)。Gao等［14］利用 SDS-PAGE與LC-MS/MS技術(shù)比較了PDR的蛋白質(zhì)變化，結(jié)果顯示，與DM患者但無(wú)視網(wǎng)膜病變者(NDR)比較，PDR患者玻璃體液中血管緊張?jiān)磉_(dá)升高，而鈣結(jié)合蛋白-1、光間受體視黃醛結(jié)合蛋白與神經(jīng)絲氨酸抑制蛋白明顯表達(dá)降低;與DM患者但無(wú)視網(wǎng)膜病變者以及非DM患者相比，PDR患者玻璃體液中氧化還原修飾酶-1表達(dá)增加，超氧化物歧化酶水平降低。該研究進(jìn)一步開(kāi)拓了對(duì)于DR特別是PDR的發(fā)病機(jī)制的理解。

由于黃斑裂孔(MH)病變影響玻璃體液的蛋白質(zhì)成分可能性小，而且取樣更符合倫理學(xué)原則，因此目前研究中MH往往作為DR蛋白質(zhì)組學(xué)研究的對(duì)照組。Nakanishi等［15］運(yùn)用2-DE與MS分析比較了DR和MH患者玻璃體內(nèi)可溶性蛋白的不同。共檢測(cè)出52種不同的蛋白。與MH患者相比，DR患者玻璃體中免疫球蛋白、α1-胰蛋白酶、α2-硫酸肝素糖蛋白與補(bǔ)體C4等蛋白豐度表達(dá)增高。同時(shí)在DR患者玻璃體中檢出色素上皮源性因子(PEGF)。作者認(rèn)為，這種強(qiáng)有力的新生血管抑制因子PEGF出現(xiàn)在以增生性新生血管為特征的DR患者玻璃體中，是否代表著玻璃體微環(huán)境平衡打破后的自身代償與恢復(fù)機(jī)制，而能否將其當(dāng)作增生性DR治療的又一方向，尚待進(jìn)一步探討。隨后Yamane等［16］分別將DR與MH患者的玻璃體與各自相對(duì)應(yīng)的血清進(jìn)行蛋白質(zhì)成分比較，發(fā)現(xiàn)烯醇化酶與過(guò)氧化氫酶在DR患者血清中未檢出，在MH玻璃體中為陰性，僅僅出現(xiàn)于DR患者的玻璃體中，提示兩者與DR的發(fā)生相關(guān)。新近Garcia-Rameriez等［17］應(yīng)用DIGE技術(shù)分析PDR患者與MH患者的蛋白質(zhì)差異。共檢出差異蛋白點(diǎn)41個(gè)，其中28個(gè)上調(diào)，13個(gè)下調(diào)。共鑒定出11種蛋白，其中上調(diào)蛋白8種，分別為鋅α2-糖蛋白、載脂蛋白A-I、載脂蛋白H、纖維蛋白原A、補(bǔ)體 C3，C4b，C9以及補(bǔ)體因子 B;下調(diào)蛋白3種，則是色素上皮衍生因子、間質(zhì)性視黃醇結(jié)合蛋白與α胰蛋白酶抑制劑重鏈前體。作者并且采用蛋白印跡以及實(shí)時(shí)PCR技術(shù)驗(yàn)證了鋅α2-糖蛋白、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體因子B、色素上皮衍生因子與間質(zhì)性視黃醇結(jié)合蛋白。這些蛋白與抑制細(xì)胞增殖、激活補(bǔ)體系統(tǒng)、新生血管形成以及視色素的再生等有關(guān)，參與了DR的病理機(jī)制。該課題組還作了進(jìn)一步研究［18］，結(jié)果顯示，光間受體視黃醛結(jié)合蛋白在 DR早期階段明顯下調(diào)，其與視網(wǎng)膜神經(jīng)變性有關(guān);而載脂蛋白A-I與載脂蛋白H則在PDR患者中明顯上調(diào)，前者可能有抗氧化應(yīng)激作用，后者可能有防止細(xì)胞凋亡功能。

3.3.2 DR 患者視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)組研究 Ann 等［19］應(yīng)用免疫印跡方法分析PDR患者、NPDR患者、DM患者與正常對(duì)照者血清以及正常對(duì)照者視網(wǎng)膜可溶性蛋白質(zhì)的變化，并采用2-DE和ESI-MS/MS進(jìn)行鑒定，繼而運(yùn)用兔醛縮酶進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)以篩選DR的自身血清抗體，并以ELISA檢測(cè)抗體滴度。結(jié)果證實(shí)，與DR患者血清反應(yīng)的20個(gè)蛋白點(diǎn)，其中14個(gè)蛋白點(diǎn)只發(fā)現(xiàn)于DR患者血清，4個(gè)蛋白點(diǎn)在PDR患者與NPDR患者血清中均存在。研究還顯示，DR血清中的確存在一種抗醛縮酶-C抗體高表達(dá)，其滴度顯著高于正常對(duì)照者以及未發(fā)生視網(wǎng)膜病變的DM患者，但PDR患者與NPDR患者中抗醛縮酶-C抗體滴度無(wú)顯著差異。作者分析，基于醛縮酶-C只出現(xiàn)于腦部在神經(jīng)元表達(dá)，其自身抗體出現(xiàn)說(shuō)明DR患者血-視網(wǎng)膜屏障的破壞，提示抗醛縮酶-C抗體可作為一種DR的診斷性標(biāo)記物進(jìn)行臨床檢測(cè)。該研究提出了自身免疫機(jī)制可能也參與了DR的病理過(guò)程，拓寬了DR研究的新觀點(diǎn)。

4 小結(jié)

綜上所述，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法在DM研究中的應(yīng)用，已部分揭示了DR的病理生理機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了一些與DR的相關(guān)蛋白，展示了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在DR研究中的應(yīng)用前景。相信隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，勢(shì)必更加完善DR發(fā)病機(jī)制的詮釋?zhuān)玫卦\治DR。

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