劉曉冬，金宇斌，代貴江，蘇云明

(1．牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157010;2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有相對(duì)復(fù)雜的過程。篩選、研發(fā)具有抑制腫瘤新生血管生成、阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移途徑的中藥新藥，充分發(fā)揮中藥的特色和優(yōu)勢(shì)，對(duì)于控制腫瘤意義不可估量。故本課題組針對(duì)中藥抗腫瘤進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明種小鼠40只，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP提供，合格證:黑動(dòng)字第P00101006號(hào)。

1．2 實(shí)驗(yàn)瘤株

肝癌細(xì)胞株H22購于黑龍江省哈醫(yī)大附屬三院腫瘤研究所。

1．3 實(shí)驗(yàn)藥品

靈芪膠囊(由重樓、山慈菇、五味子、人參、山藥、枸杞子、茯苓組成，生藥含量為每粒膠囊1．65g，現(xiàn)用現(xiàn)配，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室提供);復(fù)方環(huán)磷酰胺片(齊魯藥業(yè)，國藥準(zhǔn)字H12021006)。

1．4 主要試劑

免疫組化二步法檢測(cè)試劑盒(bFGF)。

1．5 主要實(shí)驗(yàn)器材

萊卡切片機(jī)、組織包埋機(jī)(BM－VI);超凈工作臺(tái)(BIOLOGICAL Safefy Casinets);電熱恒溫箱培養(yǎng)箱(DXm 1200FH－Ⅲ－E600);數(shù)碼相機(jī)拍照系統(tǒng)(DXm 1200FH－Ⅲ－E600)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 H22細(xì)胞株的傳代培養(yǎng)

取H22荷瘤的腹水小鼠，抽取腹水，在冰盤上將H22細(xì)胞株與生理鹽水按照預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索的比列1:10稀釋，注入健康小鼠腹腔，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物輸入量為0.2ml，每天攝取食、水，進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。觀察7天，則可見實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹部具有漲大感，用手按發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹部波動(dòng)感，說明大量腹水生成。

2．2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹圃?/h3>

在低溫條件下抽取生長(zhǎng)良好的傳代小鼠的腹水，將抽出的腹水充滿腫瘤細(xì)胞，將腫瘤細(xì)胞腹水與無菌生理鹽水1:3稀釋，按0．2ml/只的體積接種，先行常規(guī)皮膚消毒，接種部位為小鼠右前肢腋部皮下組織，等待生長(zhǎng)。

2．3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

將荷瘤小鼠隨機(jī)分組，共分為6組，分別為模型組、復(fù)方環(huán)磷酞胺片(CYT)對(duì)照組、靈芪膠囊高劑量組［LQC(H)］、中劑量組［LQC(M)］、低劑量組［LQC(L)］、復(fù)方環(huán)磷酰胺片 +中劑量靈芪膠囊(LQC+CYT)組;各組均灌胃給藥，CYT組39mg/kg、LQC(H)4．4g/kg、LQC(M)2．2g/kg、LQC(L)1．1g/kg，LQC 2.2g/kg+CYT39mg/kg，模型組給等體積生理鹽水，連續(xù)給藥21天，于末給藥后第2天，處死動(dòng)物取瘤組織。

2．4 H22小鼠移植瘤bFGF的表達(dá)

取各組的瘤組織標(biāo)本后，以10%甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水后用石蠟進(jìn)行包埋。將包埋標(biāo)本的石蠟塊制成連續(xù)切片，厚度約為3μm，切片采用鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化酶連接(S－P)免疫組化方法染色。具體步驟按照說明書嚴(yán)格操作。

2．5 染色標(biāo)準(zhǔn)

參照Mattern［1］方法判定實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果。染色深度:未見染色:0(－);輕度染色:1(+，呈淺黃色);中度染色為:(++，呈棕黃色);深度染色:3(+++，呈棕褐色)。陽性細(xì)胞百分比:未染色:0(－);染色細(xì)胞＜25%:1(+);25% ～50%:2(++);染色細(xì)胞 ＞50%:3(+++)。染色深度和陽性細(xì)胞百分比和0～2分者判為陰性表達(dá);＞2分(3～6)者判為陽性表達(dá)。

2．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS10．8統(tǒng)計(jì)軟件包分析，結(jié)果用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

靈芪膠囊對(duì)H22小鼠移植瘤bFGF表達(dá)的影響，見表1。

表1 靈芪膠囊對(duì)H22小鼠移植瘤bFGF表達(dá)的影響

bFGF主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，陽性染色表現(xiàn)為胞漿均勻棕黃色細(xì)顆粒狀染色。LQC高、中、低組表達(dá)率分別為1/8、2/8、1/8，對(duì)照組表達(dá)率為3/8，分析兩組瘤體的染色度及陽性細(xì)胞百分比，結(jié)果顯示，LQC治療組的染色程度及陽性細(xì)胞百分比均明顯低于對(duì)照組，差異有顯著性意義(P＜0．05)。

4 討論

bFGF是有促血管生成作用的多肽因子之一，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，尤其對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞作用更為明確，能夠促進(jìn)形成毛細(xì)血管。bFGF在體內(nèi)的另一重要功能是誘導(dǎo)新生血管的形成［2］。故bFGF與腫瘤的生長(zhǎng)、增殖密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)以免疫組化法檢測(cè)LQC對(duì)H22荷瘤小鼠血管生成因子bFGF蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LQC能下調(diào)H22荷瘤小鼠瘤組織bFGF蛋白的表達(dá)，其抗腫瘤機(jī)制可能是通過下調(diào)bFGF因子的表達(dá)，抑制血管的生長(zhǎng)，從而抑制腫瘤新生血管的生成，達(dá)到抑制腫瘤的生長(zhǎng)的作用。

［1］Mattern J，Koomagi R，Volm M．Association of vascular endothelial growth factor expression with intratumoralmicrovessal density and tumoral proliferation in human epidermoid lung carcinoma［J］．Br J Cancer，2009，73(2):931 －934．

［2］秦艷芳．堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子與腫瘤［J］．國外醫(yī)學(xué)·腫瘤學(xué)分冊(cè)，2009，28:257－258．