趙雪瑩，王浩然，旺建偉，畢珺輝，柴劍波，李冀

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

二至丸出自于明·王三才的《醫(yī)便》，由女貞子、旱蓮草組成，具有益肝腎、補陰血、壯筋骨、烏須發(fā)之功，為臨床常用滋養(yǎng)肝腎的名方之一。中老年人多見肝腎陰虛，對二至丸的抗衰老研究將具有重要的社會意義。因此以D－半乳糖致衰老大鼠為模型，觀察二至丸的抗衰老的可能作用途徑。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物 健康Wistar大鼠70只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，合格證為黑動字第P00102006，分籠飼養(yǎng)，室溫18～25℃，空氣新鮮，通風良好，自由攝食、飲水。1．1．2 實驗用藥及制備

二至丸:女貞子1 000g、旱蓮草1 000g和蜂蜜120g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二門診部。女貞子粉碎，研細，過100目篩，備用;旱蓮草加水適量煎煮兩次，每次1h，合并煎液，加入女貞子細末和蜂蜜120g，攪勻后加入蒸餾水，配制成實驗所需低、中、高不同濃度的溶液:0．162g/ml、0．324g/ml 和 0．648g/ml。每周定期制備各組藥液，4℃保存，使用前加溫至37℃。

1．1．3 主要儀器及試劑 TN型托盤式扭力天平(上海第二天平儀器廠);TGL－16G臺式高速離心機(上海醫(yī)用分析儀器廠);722型光柵分光光度計(山東高密分析儀器廠);Na+－K+－ATPase測試盒(南京建成生物工程研究所，批號20060916);Ca2+－Mg2+－ATPase測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20060906)。

1．2 方法

1．2．1 動物分組

Wistar大鼠(雌雄各半)70只，隨機分為正常對照組、模型組、維生素E組、六味地黃丸組、二至丸低劑量組、二至丸中劑量組和二至丸高劑量組，每組10只，適應性飼養(yǎng)1周后造模。

1．2．2 造模方法

采用D－半乳糖致亞急性衰老法［1］，將D－半乳糖5 000mg溶于500ml生理鹽水中，按注射劑量100mg/kg/d給大鼠腹腔注射，正常對照組注射等體積生理鹽水，造模時間為8周，每周稱質(zhì)量1次，依據(jù)末次稱質(zhì)量的克數(shù)調(diào)整給藥劑量。

1．2．3 給藥方法

模型復制成功后，各治療組從第9周始每日上午分別灌胃給藥，正常對照組和模型對照組給等體積的生理鹽水，每日1次。根據(jù)實驗大鼠與人的體表面積比例系數(shù)換算，確定二至丸低劑量組每日灌服1．62g/kg，中劑量組每日灌服3．24g/kg，高劑量組每日灌服6．48g/kg，六味地黃丸組每日灌服1．62g/kg，維生素 E組每日灌服0．027g/kg。每周稱質(zhì)量1次，依據(jù)大鼠末次體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量。給藥時間10周。

1．3 指標測定 準確稱取大鼠肝組織質(zhì)量，按質(zhì)量體積比制成10%的勻漿，再取一定量的10%的勻漿加99倍的生理鹽水制成0．1%的組織勻漿0．1ml，同時用考馬斯亮蘭試劑測定組織蛋白。按照說明書操作，并計算其活力值。

1．4 統(tǒng)計方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件進行處理，結(jié)果用(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

二至丸對D－半乳糖致衰老大鼠肝細胞膜Na+－K+－ATPase、Ca2+－Mg2+－ATPase活性的影響，結(jié)果見表1。

表1 二至丸對D－半乳糖致衰老大鼠肝細胞膜Na+－K+－ATPase、Ca2+Mg2+－ATPase活性的影響(±s)

表1 二至丸對D－半乳糖致衰老大鼠肝細胞膜Na+－K+－ATPase、Ca2+Mg2+－ATPase活性的影響(±s)

注:與模型對照組比較，▲P＜0．05，▲▲P＜0．01;與正常對照組比較，★P ＜0．05，★★ P ＜0．01;與二至丸低劑量組比較，◆ P ＜0．05，◆◆P ＜0．01。

組別 n Na+－K+－ATPase(U/mgprot)Ca2+－Mg2+－ATPase(U/mgprot)正常對照組 10 7．604±0．550▲▲ 6．906±0．661▲▲模型組 10 5．436 ±0．784 5．229 ±0．801維生素 E 組 10 6．941±0．581▲▲★ 6．812±0．446▲▲◆◆六味地黃丸組 10 6．848±0．667▲▲★ 6．493±0．548▲▲◆二至丸低劑量組 10 6．593±0．508▲▲★ 5．892±0．452▲★★二至丸中劑量組 10 6．410 ±0．452▲▲★ 6．703 ±0．472▲▲◆◆二至丸高劑量組 10 6．862±0．477▲▲★ 6．647±0．641▲▲◆

由表1可見，造模后，模型對照組大鼠肝細胞膜Na+－K+－ATPase、Ca2+－Mg2+－ATPase活性明顯低于正常對照組，具有顯著性差異(P＜0．01)，說明大鼠衰老后組織中二者活性明顯減低。對于Na+－K+－ATPase的升高作用，二至丸各劑量組作用相當，無顯著性差異(P﹥0．05);對于Na+－K+－ATPase的升高作用，二至丸各劑量組之間存在差異，低劑量組作用不及中、高劑量組(P＜0．05，P＜0．01)，說明二至丸在提高肝細胞膜Ca2+－Mg2+－ATPase的活性在一定范圍內(nèi)存在量效關(guān)系。

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)Ca2+的超載與衰老的老年性疾病變化密切相關(guān)，而Na+－K+－ATP酶、Ca2+－Mg2+－ATP酶的活性是Ca2+正常分布的基礎(chǔ)，現(xiàn)已作為觀察衰老的新指標［2］。Na+－K+－ATP酶功能的正常依賴于脂膜的存在與膜的流動性的正常［3］，該酶的活性調(diào)節(jié)可賦于細胞必要的生命力，其活性隨增齡而下降，其活性下降與自由基及代謝產(chǎn)物誘發(fā)的膜結(jié)構(gòu)受損有關(guān)［4］，即自由基反應可以通過改變膜脂質(zhì)構(gòu)成與降低膜的流動性影響Na+－K+－ATP酶的活性。Na+－K+－ATP酶活性的下降，將導致細胞內(nèi)能量生成和離子轉(zhuǎn)運障礙，從而影響細胞的功能，引起衰老［5］。在異常狀態(tài)下，細胞膜的通透性增加，Ca2+通道開放，使得細胞外Ca2+大量內(nèi)流，如細胞、ATP減少，使活性降低，細胞內(nèi)Na+水平升高，Na+－Ca2+交換增加，使Ca2+內(nèi)流增加;可導致細胞內(nèi)Ca2+超載［6］。Ca2+超載一方面直接引起線粒體損害，又可使細胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)的生化反應發(fā)生紊亂，激活許多降解酶，會進一步導致細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的異常，從而引起細胞死亡。Ca2+水平的升高可使細胞骨架和膜不穩(wěn)定，并可激活Ca2+依賴性降解酶，如磷脂酶、蛋白酶和內(nèi)切酶［7］，磷脂酶使膜磷脂水解，花生四烯酸釋放增加，同時又產(chǎn)生大量自由基，使膜通透性增大，造成惡性循環(huán)［8－9］。

從實驗結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，D－半乳糖致衰老大鼠肝組織Ca2+－Mg2+－ATP酶和Na+－K+－ATP酶的值與正常對照組相比明顯降低，而各治療組對其均有不同程度的提高作用，在提高Na+－K+－ATP酶的活性方面，二至丸低劑量組即具有較好的作用;在提高Ca2+－Mg2+－ATP酶活性方面，二至丸中劑量組較之二至丸低劑量組發(fā)揮更好的作用，提示本方在一定范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。提示本方通過增強細胞膜上離子轉(zhuǎn)運的能力而起到延緩衰老的作用，其機制可能與提高細胞膜上的Na+－K+－ATP酶和Ca2+－Mg2+－ATP酶的活性，減少自由基對細胞膜的損傷，維持細胞膜的穩(wěn)定性和Ca2+的穩(wěn)態(tài)，從而發(fā)揮抗衰老作用。

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