王加志，劉樹民，湯青，李偉

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007;2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040)

黃藥子臨床應(yīng)用時肝損害時有報道［1］，表明人們對用藥安全的關(guān)注日益加深。本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃藥子的肝損害作用與氧化應(yīng)激有關(guān)［2］。本研究通過對肝細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的初步研究，探討氧化應(yīng)激與肝細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化情況，為從細(xì)胞凋亡及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面研究中藥肝損害奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1．1 實驗儀器

LSM－510－META激光共聚焦掃描顯微鏡(德國ZEISS公司);倒置式顯微鏡(Axiovert 200 MBP);BQ 50－1J恒流泵(河北保定蘭格恒流泵有限公司);KDC－160HR高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。

1．2 試劑

FLUO－3 AM(美國分子探針(AP)公司);胰蛋白酶(美國SIGMA公司);Ⅳ型膠原酶(美國SIGMA公司);PBS(美國SIGMA公司);DMEM培養(yǎng)基(美國SIGMA公司);DMSO(美國SIGMA公司);試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．3 實驗動物

雄性SD大鼠4只，體質(zhì)量(250±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評價中心(GLP)提供，動物質(zhì)量合格證書號:醫(yī)動字第01－10－2號。

1．4 實驗藥物

黃藥子購于黑龍江省藥材公司，產(chǎn)地河北，經(jīng)黑龍江省藥檢所鑒定為薯蕷科植物黃獨(Dioscorea bulbifera L．)的塊莖。黃藥子二萜內(nèi)酯類組分制備按前期實驗［3］，其在原藥材中含量為 0．568%。

1．5 動物分組及給藥量

SD大鼠4只，分為空白對照組、肝毒性組各2只，灌胃給藥，肝毒性組給藥量為0．064 8g/kg，相當(dāng)于生藥2．85g/kg。日兩次，空白對照組為含吐溫－80同等濃度的蒸餾水，共7天。

1．6 樣品制備

1．6．1 細(xì)胞內(nèi)Ca2+測定樣品

取SD雄性大鼠4只，于末次給藥12h后，斷椎處死，把整個動物浸入盛有75%乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消毒的剪刀剪開腹部皮膚，暴露肝臟，置于無菌灌流臺中，加膠原酶50mg于滅菌的 PBS液200ml中，循環(huán)灌洗肝臟15min，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用PBS清洗，移入無菌離心管中，加入0．25%的胰蛋白酶適量，37℃水浴中消化8～10min，每隔幾分鐘搖動一下試管，使組織與消化液充分接觸，靜止，吸去上清，向離心管中加入5～10ml含5%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，用吸管吹打混勻，即得。

1．6．2 FLUO －3 AM 工作液的配制

FLUO－3 AM 50μg溶解于40μl無水二甲基亞砜(DMSO)中即成貯備液，貯備液加入DMEM培養(yǎng)基

基金項目:黑龍江省中醫(yī)藥管理局資助課題(ZHY10－Z02)

作者簡介:王加志(1977－)，男，副教授，博士，主要從事中藥藥性理論研究。

通訊作者:劉樹民(1963－)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥臨床藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及中藥藥性理論研究。

收稿日期:2012－06－12

修回日期:2012－07－10

10ml即得4．4μm 的工作液。

FLUO－3的共聚焦顯微鏡激發(fā)光峰值波長為490nm，用于檢測的熒光峰值波長為525nm，掃描點面積 0．053 1mm2。

1．6．3 FLUO －3 染色方法

使用時按實際情況將工作液適當(dāng)稀釋，最低稀釋至濃度為2μm。取細(xì)胞懸液100μl，加入10μl熒光染料，加入DMEM培養(yǎng)基至1 000μl，培養(yǎng)箱中37℃反應(yīng)15min后測定，從染料加入到測定完成，不超過40min。本實驗使用的濃度為2．2μm。

2 結(jié)果

細(xì)胞內(nèi)Ca2+測定結(jié)果:在生理情況下，Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)第二信使，在維持細(xì)胞增殖、分裂、運動、能量代謝、氧代謝、Ca2+依賴蛋白激酶和磷脂酶的激活等方面發(fā)揮著重要作用。而這種作用的正常發(fā)揮則依賴于肝細(xì)胞內(nèi)液約為0.2μmol/L的Ca2+濃度和細(xì)胞外液約1．3mmol/L的Ca2+濃度，即肝細(xì)胞始終處于胞內(nèi)外1萬倍濃度梯度差，懸殊的電化學(xué)梯度正是Ca2+發(fā)揮第二信使作用所必需的，也表明肝細(xì)胞內(nèi)有著強(qiáng)有力的Ca2+穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體是胞內(nèi)最主要的鈣庫，因而線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起著主導(dǎo)作用。以空白對照組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度為基準(zhǔn)，評價干預(yù)因素黃藥子毒性組分對肝細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響。

空白組:空白組細(xì)胞數(shù)量多，形態(tài)規(guī)整，熒光染料染色均一，亮度適中，以背景形鮮明對照，適合觀察，證明以fluo－3為熒光染料負(fù)載的細(xì)胞懸液樣品制備成功。

黃藥子組:同等條件下制備的細(xì)胞懸液中，細(xì)胞數(shù)量最少，在相同的觀察條件下，細(xì)胞的熒光亮度最強(qiáng)，說明細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+含量增高。結(jié)果見圖1。

3 討論

本實驗使用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)和新一代的胞內(nèi)游離Ca2+探針fluo－3/AM(典型的單波長熒光探針)，發(fā)射波長較長，熒光選擇性強(qiáng)，自身無熒光，只有與乙酰甲酯AM相連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解并與游離鈣結(jié)合后才發(fā)出熒光，能有效地避免非特異性染色，不需要紫外光激發(fā)，避免了紫外光對活細(xì)胞樣品的損傷，不需要制作工作曲線。

Ca2+作為主要的細(xì)胞內(nèi)信使，同時也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)－線粒體交流的主要“語言”，與凋亡密切相關(guān)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的升高會導(dǎo)致鈣離子轉(zhuǎn)移到線粒體［4－5］，引起線粒體 Δψm 下降，損傷線粒體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。線粒體膜的損傷又可導(dǎo)致Ca2+進(jìn)一步升高，形成惡性循環(huán)，加重細(xì)胞的損害。

圖1 鈣離子激光共聚焦掃描圖

黃藥子可損傷肝細(xì)胞線粒體，并生成大量的氧自由基［3］，線粒體損傷后，肝細(xì)胞ATP缺乏，胞膜受損，跨膜Ca2+內(nèi)流增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+增多，胞膜Ca2+泵排Ca2+能力和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜Ca2+－Mg2+－ATP酶攝Ca2+能力減弱，結(jié)果導(dǎo)致胞漿內(nèi)鈣超載，線粒體保護(hù)性攝取胞漿內(nèi)游離Ca2+以平衡鈣穩(wěn)態(tài)，最終會導(dǎo)致自身鈣超載，故肝細(xì)胞鈣超載必然伴隨線粒體鈣超載。

［1］李維昌，楊軍，李惠文，等 黃藥子致藥物性肝病1例［J］．臨床合理用藥，2009，2(15):79．

［2］李偉，趙艷，湯青，等．黃藥子醇提物肝臟毒性部位篩選研究［J］．中醫(yī)藥信息，2009，26(1):28 －29．

［3］王加志．黃藥子中二萜內(nèi)酯類成分對大鼠肝細(xì)胞損傷作用的實驗研究［J］．藥物不良反應(yīng)雜志，2009，11(1):13 －16．

［4］洪莉，蔡威．凋亡與肝細(xì)胞損傷機(jī)制的研究進(jìn)展［J］．臨床小兒外科雜志，2006，5(1):42 －46．

［5］Kim JH，Choi S，Jung JE，et al．Capacitative Ca2+entry is inv － olved in regulating soluble amyloid precursor protein(sAPPα)release me-diated by muscarinic acetylcholine receptor activation in neuroblastoma SH － SY5Y cells［J］．J Neurochem，2006，97(1):245－254．