姚麗，霍紅，韓月，劉天一

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150081)

獨(dú)活是傘形科植物重齒當(dāng)歸的干燥的根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品。具有祛風(fēng)除濕，通痹止痛的功效。由于各個(gè)朝代的藥物著作對(duì)其記載不同，自古以來獨(dú)活種類繁多。藥材因產(chǎn)地分布、性狀差異而形成不同的商品獨(dú)活，在全國(guó)范圍內(nèi)其代用品及來源于其他植物的20多種藥材仍被作為獨(dú)活應(yīng)用。據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》記載，獨(dú)活正品來源于傘形科植物重齒毛當(dāng)歸的干燥根，目前主產(chǎn)于四川，因此又稱“川獨(dú)活”。因而，全面、系統(tǒng)的鑒定獨(dú)活的真?zhèn)蝺?yōu)劣尤為重要。本文應(yīng)用了生藥學(xué)鑒定方法細(xì)致地對(duì)川獨(dú)活樣品進(jìn)行鑒別，以期為其鑒定及進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1．1 儀器

打粉機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司);分析天平(梅特勒－托利多儀器有限公司);超聲機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);紫外燈(上海嘉鵬科技有限公司);顯微鏡(上海儀圓光學(xué)顯微鏡廠);高效液相色譜儀(SHIMADZU);色譜柱(SHIMADZU)。

1．2 材料

獨(dú)活飲片樣本(購(gòu)于哈爾濱市五大藥店);蛇床子素(西安天本生物有限公司);水合氯醛(AR，武漢市和昌化工有限公司);甲醇(AR，西隴化工股份有限公司);乙醇(AR，西隴化工股份有限公司);石油醚(AR，天津市富宇精細(xì)化工有限公司);乙酸乙酯(AR，天津市富宇精細(xì)化工有限公司);冰乙酸(色譜純，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠);甲醇(色譜純，沈陽(yáng)市華東試劑廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 性狀鑒別

5個(gè)獨(dú)活飲片樣本(購(gòu)于哈爾濱市五大藥店，鑒定人金銳教授，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生藥教研室)，目視觀察獨(dú)活樣品橫切面的性狀特征并進(jìn)行比較。

2．2 顯微鑒別

用打磨機(jī)分別將五種獨(dú)活樣品打磨成粉末并標(biāo)號(hào)，用牙簽取少許粉末置于載玻片，滴2～3滴水合氯醛，用酒精燈加熱至沸騰，蓋上蓋玻片(從一側(cè)輕觸載玻片，避免產(chǎn)生氣泡)，置于數(shù)碼顯微鏡下觀察獨(dú)活的顯微特征。

2．3 薄層色譜法

分別取五種獨(dú)活樣品粉末0．1g，加甲醇1ml，超聲處理15min，靜置，取上清液作為供試品溶液。另取蛇床子素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，加甲醇，分別制成每1ml含0．4mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。用毛細(xì)管分別吸取五種樣品及對(duì)照品溶液點(diǎn)于同一硅膠GF薄層板上，以石油醚(60℃ ～90℃)－乙酸乙酯(7∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(365nm)下檢視。

2．4 高效液相色譜法

2．4．1 色譜條件

高效液相色譜儀(Waters 600E);色譜柱:Kromasil C18(中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所);流動(dòng)相:甲醇－1%的冰乙酸水溶液(60∶20);檢測(cè)波長(zhǎng):300nm;柱溫:室溫;流速:1．0 mL/min。

2．4．2 對(duì)照品溶液的制備

取蛇床子素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇配成每1ml含30μg的溶液，即得。

2．4．3 供試品溶液的制備

分別取五種樣品粉末約0．5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20ml密塞，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液12．5ml，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2．4．4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系

精密稱取在60℃減壓干燥4h的蛇床子素對(duì)照品3．50mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得(35．0μg/mL)，作為對(duì)照品溶液。在已選定的條件下分別精密吸取 2，4，6，8，10μL 進(jìn)樣，按色譜條件測(cè)得峰面積積分值，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，蛇床子素進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

2．4．5 精密度考察

精密吸取蛇床子素對(duì)照品溶液(35．0μg/mL)10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積積分值。

2．4．6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品，按樣品測(cè)定法重復(fù)測(cè)定5次，得平均含量。

2．4．7 回收率試驗(yàn)

取已知含量的獨(dú)活樣品(含量為0．231 6mg/g)6份，每份約1．5g，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照品溶液(0．034 89mg/ml)各10ml，再按“1．4．3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，HPLC分析，進(jìn)樣量均為10μl。

2．4．8 樣品的測(cè)定

測(cè)定時(shí)分別精密吸取對(duì)照品溶液10μl與五種供試品溶液10μl。注入液相色譜儀，按本色譜條件測(cè)定，即得。

3 結(jié)果

3．1 性狀鑒別

質(zhì)堅(jiān)硬，斷面灰黃白色，形成層環(huán)棕色，皮部有棕色油點(diǎn)(油管)，木部黃棕色;根頭橫斷面有大形賄部，亦有油點(diǎn)。香氣特異，味苦辛，微麻舌，以條粗壯、油潤(rùn)、香氣濃者為佳(結(jié)果見圖1)。

圖1 獨(dú)活樣品

3．2 顯微鑒別

獨(dú)活的橫切面:木栓細(xì)胞數(shù)列，栓內(nèi)層窄，有少數(shù)油室。韌皮部約占根的1/2;油室較多，排成數(shù)輪;形成層成環(huán)。木質(zhì)部射線寬1～2列細(xì)胞;導(dǎo)管稀少，常單個(gè)徑向排列。薄壁細(xì)胞含淀粉粒。

獨(dú)活粉末:呈淡黃色或淡棕色。油室多破碎;主要為網(wǎng)紋導(dǎo)管，亦有螺紋導(dǎo)管;木栓細(xì)胞無色或棕色，表面呈多角形，壁稍厚，略呈波狀彎曲，木化，有的細(xì)胞內(nèi)含棕色物;薄壁細(xì)胞類圓形或類方形，細(xì)胞間隙明顯。淀粉粒較多，細(xì)小，單粒類圓形或橢圓形。(結(jié)果見圖2)

圖2 獨(dú)活顯微特征的數(shù)碼圖片及墨線圖(1．油室碎片;2．網(wǎng)紋導(dǎo)管;3．螺紋導(dǎo)管;4．木栓細(xì)胞;5．薄壁細(xì)胞;6．淀粉粒)

3．3 薄層色譜鑒別

在本實(shí)驗(yàn)條件下，樣品中的蛇床子素與標(biāo)準(zhǔn)品的熒光斑點(diǎn)重心在同一直線上，斑點(diǎn)圓潤(rùn)、清晰無拖尾現(xiàn)象，主斑點(diǎn)與其他斑點(diǎn)分離較好。結(jié)果見圖3。

圖3 獨(dú)活的薄層鑒別色譜圖

3．4 高效液相色譜法

理論塔板數(shù)以蛇床子素計(jì)算均不低于25 000，色譜峰之間及與相鄰峰之間分離度均大于1．5，對(duì)稱因子均0．95～1．05之間。獨(dú)活中蛇床子素的線性范圍為:29．8 ～182．7μg/mL(r=0．999 8)。平均回收率為98．47%，RSD=1．25%(n=9)。蛇床子素精密度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，RSD=0．43% 和0．36%。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，樣品溶液成分在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好(結(jié)果見圖4)。

按照上述方法對(duì)5種樣品進(jìn)樣10ul，結(jié)果蛇床子素含量見表1。

表1 蛇床子素含量(%)

4 討論

我國(guó)中藥資源豐富，種源廣泛，現(xiàn)有藥材達(dá)12 807種，其中植物藥11 146種，占其總數(shù)的87%［1］。中藥作為中醫(yī)防病治病的物質(zhì)基礎(chǔ)，它的品種和質(zhì)量是其價(jià)值所在。生藥鑒定，僅憑手、眼、口、鼻、耳的感覺，觀其形，聽其聲，嗅其氣，嘗其味等已不足以判斷中藥的真?zhèn)蝺?yōu)劣［2］。隨著科技發(fā)展，中藥研究的不斷深入，人們對(duì)于中藥質(zhì)量的要求越來越高。中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)是中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵，沒有中藥鑒定方法的現(xiàn)代化，就不能保證中藥的質(zhì)量及用藥安全。本文所采用的鑒定方法是以2010版《中國(guó)藥典》為依據(jù)，全面系統(tǒng)地對(duì)獨(dú)活藥材進(jìn)行了鑒定及比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從性狀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜法基本可以鑒別出藥材的真?zhèn)?，而藥材的?yōu)劣需采用高效液相色譜法進(jìn)行定量檢測(cè)。

性狀鑒別是傳統(tǒng)生藥鑒別方法，是辨別真?zhèn)蔚牡谝魂P(guān)。在我國(guó)醫(yī)藥學(xué)寶庫(kù)中積累著豐富的鑒別經(jīng)驗(yàn)，具有簡(jiǎn)單、易行、迅速的特點(diǎn)。但對(duì)于性狀相近或是同一科屬的中藥材的分辨率較低。根圓錐狀，褐色，多分枝以及特異香氣是獨(dú)活的主要性狀特征，然而其他傘形科植物的形態(tài)特征與其相近，難以辨別。顯微技術(shù)突破了人類的視覺局限，使觀察范圍得以延伸，可觀察植物的內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征。揮發(fā)油為多數(shù)傘形科植物共有的化學(xué)成分，因而鏡下必見油室，而木栓細(xì)胞、薄壁細(xì)胞為鏡下觀察的主要特征。與墨線圖相比，數(shù)碼顯圖片更清晰，細(xì)致?？勺鳛楠?dú)活鑒別的結(jié)構(gòu)依據(jù)。從目測(cè)及鏡下觀察，基本可以鑒定真?zhèn)?，但藥材的?yōu)劣還需要對(duì)主要成分進(jìn)行定性與定量分析，因而本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法進(jìn)行定性檢測(cè)。薄層色譜法是2010年版中國(guó)藥典一部中鑒別中藥的最常用方法［2］。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照藥典提供的條件進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)樣品中的蛇床子素與標(biāo)準(zhǔn)品的熒光斑點(diǎn)重心在同一直線上，斑點(diǎn)圓潤(rùn)、清晰無拖尾現(xiàn)象，主要成分為蛇床子素。為挑選質(zhì)量最優(yōu)樣本作為后續(xù)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，于是采用高效液相色譜法測(cè)定蛇床子素的含量。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，文獻(xiàn)報(bào)道常使用的流動(dòng)相為乙腈－水，甲醇－水，甲醇－冰乙酸水溶液等。由于乙腈毒性較大，實(shí)驗(yàn)室較少使用，通過比較了甲醇－水與甲醇－冰乙酸水溶液的分離效果之后，發(fā)現(xiàn)以甲醇－體積分?jǐn)?shù)為1%的冰乙酸水溶液(60∶20)為流動(dòng)相分離效果較好［3－5］。獨(dú)活提取液的成分復(fù)雜，粘性較大，容易造成色譜柱的堵塞，本實(shí)驗(yàn)將對(duì)照品溶液濃度調(diào)試為30μg/ml，在330nm處，成功地比較了5個(gè)樣品中蛇床子素的百分含量差異，并得出樣品5中含量最高。上述幾種鑒定方法的綜合應(yīng)用可作為鑒定獨(dú)活藥材的標(biāo)準(zhǔn)。

隨著現(xiàn)代科技以及相關(guān)學(xué)科的迅猛發(fā)展，生藥鑒別也不斷涌現(xiàn)出新方法，如毛細(xì)管電泳法，紫外－可見分光光度法，紅外分光光度法，氣相質(zhì)譜聯(lián)用鑒定技術(shù)，DNA分子鑒定技術(shù)，指紋圖譜鑒定技術(shù)等［6］。單從發(fā)展趨勢(shì)看，中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可能形成兩個(gè)分支，一個(gè)是接近于化學(xué)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的有效成分的定性定量分析，它可能比較適用于處方簡(jiǎn)單，有效成分與臨床治療的指標(biāo)比較吻合的品種。另一個(gè)是中藥制劑“全成分”的色譜圖像分析或指紋圖譜分析［7］。評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量金標(biāo)準(zhǔn)是安全有效，因此，質(zhì)量控制不能孤立進(jìn)行，必須與現(xiàn)代中藥藥理及臨床研究結(jié)合，由質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)向與中醫(yī)療效評(píng)價(jià)結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)展。同時(shí)，通過生藥鑒定，為科研的源頭建立良好的開端，篩選出優(yōu)質(zhì)藥材，提取分離生物學(xué)活性成分，進(jìn)而為臨床藥理研究提供質(zhì)量保障，也為我國(guó)中醫(yī)藥的發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

［1］丁海，黃泰康，吳春福．中藥現(xiàn)代化發(fā)展的進(jìn)程和趨勢(shì)［J］．中草藥，2005，36(1):147 －149．

［2］楊汝峰．中藥鑒定學(xué)［M］．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1999:1．

［3］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典［S］．2部．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004．

［4］劉曉華，孫文基，李濤．HPLC法測(cè)定獨(dú)活中蛇床子素的含量［J］．藥物分析雜志，2004，24(2):212 －213．

［5］邢婕，胡曉靜，趙春杰．RP－HPLC法測(cè)定獨(dú)活中蛇床子素和異歐前胡素含量［J］．沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23(2):93 －94．

［6］汪秋蘭，王文清，馬永貴．高效液相色譜法在中藥有效成分含量測(cè)定中的應(yīng)用［J］．醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，11(3):1474 －1475．

［7］卓菊．鑒定中藥的常用方法［J］．黑龍江醫(yī)藥，2009(3):349－350．