張育軍，侯俊明，雒向?qū)?，柏魯寧，方永軍，張健?/p>

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院外科教研室，陜西中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合外科研究所，陜西咸陽(yáng)712046;2.廣州市中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州510080)

益腎活血顆粒由黃芪、山萸肉、懷牛膝、澤瀉、地鱉蟲(chóng)、三棱等藥物組成，為陜西中醫(yī)學(xué)院泌尿外科治療前列腺增生癥(benign prostatic hyperplasia，BPH)的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有補(bǔ)腎益氣、活血化瘀、通利水道之功效。為探討其抗前列腺增生的可能機(jī)制，我們觀察了益腎活血顆粒對(duì)前列腺增生動(dòng)物模型的前列腺質(zhì)量、病理形態(tài)及半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白酶3(Caspase-3)表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料益腎活血顆粒由陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑中心制備，批號(hào):110201;丙酸睪酮注射液，25 mg/mL，2 mL/支，上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào):090501;非那雄胺片(保列治片)每片5mg，默沙東藥廠生產(chǎn)，批號(hào):305416。一抗:Caspase-3兔抗鼠抗體，購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。電子天平;雙目光學(xué)顯微鏡;多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)。

1.2 動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠，雄性，鼠齡10～12周，體質(zhì)量200～240 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，證號(hào)SYXK(陜)2008-005。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法雄性SD大鼠40只適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，編號(hào)稱質(zhì)量，腹腔注射0.2%的戊巴比妥鈉(1 mL/kg)麻醉，無(wú)菌手術(shù)摘除雙側(cè)睪丸，經(jīng)一周恢復(fù)后隨機(jī)分為4組:模型組、益腎活血顆粒大劑量組、益腎活血顆粒小劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組。各組大鼠在每天皮下注射丙酸睪酮0.005 g/kg的同時(shí)開(kāi)始灌胃給藥，益腎活血顆粒大劑量組和益腎活血顆粒小劑量組依次每天給予2.25、1.12 g/kg灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組給予非那雄胺片0.001 g/kg灌胃，模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)28 d，每周稱體質(zhì)量以調(diào)節(jié)給藥用量。28 d后處死大鼠，摘取前列腺，稱取前列腺濕質(zhì)量，計(jì)算前列腺指數(shù)，常規(guī)HE染色觀察，測(cè)定免疫組化［1-2］。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 前列腺指數(shù)(PI)PI=前列腺質(zhì)量(mg)/大鼠體質(zhì)量(g)。

1.4.2 Caspase-3測(cè)定通過(guò)免疫組化(PV二步法)檢測(cè)前列腺組織中Caspase-3蛋白的表達(dá)。標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，脫蠟后滴加Caspase-3兔抗鼠抗體，濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜，復(fù)溫后PBS洗滌3次。再以二抗工作液覆蓋，濕盒內(nèi)孵育，PBS洗片，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察結(jié)果。caspase 3表達(dá)于上皮細(xì)胞漿中，以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒、胞核內(nèi)無(wú)著色為陽(yáng)性染色細(xì)胞。以圖像分析軟件分析測(cè)定其灰度值。

1.4.3 前列腺病理形態(tài)各組標(biāo)本行常規(guī)H.E染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠前列腺指數(shù)PI的影響益腎活血顆粒大、小劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組均能使大鼠前列腺質(zhì)量減少，前列腺指數(shù)降低。3個(gè)治療組抑制前列腺增生的效果較模型組明顯(P＜0.05)。尤以益腎活血顆粒大劑量組效果最為顯著(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠前列腺指數(shù)PI的影響(±s，n=10)

表1 各組對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠前列腺指數(shù)PI的影響(±s，n=10)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P＜0.05。

組別給藥劑量/(g·kg－1)大鼠體質(zhì)量/g前列腺質(zhì)量/mgPI/(mg·g－1)318.5±24.42.41±0.307.57±0.85益腎活血顆粒組(大劑量)2.25320.0±21.51.45±0.18＊＊△4.53±0.52＊＊△益腎活血顆粒組(小劑量)1.12317.5±29.81.82±0.25*5.73±0.56*陽(yáng)性對(duì)照組0.001316.3±25.51.68±0.17*5.41±0.72模型組－*

2.2 前列腺病理形態(tài)變化情況模型組鏡下可見(jiàn)前列腺腺體排列密集，腺上皮明顯增生，細(xì)胞為高柱狀，多數(shù)腺上皮呈乳頭狀突入腔內(nèi)，間質(zhì)纖維和平滑肌增多。益腎活血顆粒大劑量組腺體數(shù)量明顯減少，極少數(shù)呈乳頭狀突入腔內(nèi)，上皮細(xì)胞大多呈單層柱狀，間質(zhì)纖維和平滑肌少量增生。小劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組腺體數(shù)量較少，部分呈乳頭狀突入腔內(nèi)，上皮細(xì)胞呈單層柱狀及高柱狀，間質(zhì)纖維和平滑肌較多。

2.3 各組前列腺上皮組織caspase-3表達(dá)比較益腎活血顆粒大、小劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組caspase-3表達(dá)均明顯強(qiáng)于模型組。益腎活血顆粒大、小劑量組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);益腎活血顆粒大劑量組caspase-3表達(dá)與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，益腎活血顆粒大劑量組caspase-3表達(dá)明顯強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組;益腎活血顆粒小劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，益腎活血顆粒小劑量組caspase-3表達(dá)接近于陽(yáng)性對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組前列腺上皮組織caspase-3的表達(dá)(±s)

表2 各組前列腺上皮組織caspase-3的表達(dá)(±s)

注:灰度值指前列腺上皮組織中caspase-3表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞染色深度，灰度值與caspase-3含量成反比，灰度值越小，染色越深，caspase-3含量越高。與模型組比較，＊＊P＜0.01;與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P＞0.05，△△P＜0.01，與小劑量組比較，▲▲P＜0.01。

只灰度值模型組組別給藥劑量/(g·kg－1)動(dòng)物/－10157.28±6.36益腎活血顆粒組(大劑量)2.251089.53±5.37＊＊△△▲▲益腎活血顆粒組(小劑量)1.1210120.24±4.35＊＊△陽(yáng)性對(duì)照組0.00110117.50±3.41＊＊

3 討論

良性前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia，BPH)是老年男性最常見(jiàn)的疾病之一，50歲以上的男性約有一半會(huì)出現(xiàn)臨床癥狀。增生的前列腺擠壓尿道，導(dǎo)致一系列排尿障礙癥狀，如尿頻尿急、尿流細(xì)弱、尿不盡等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，不及時(shí)治療會(huì)導(dǎo)致許多嚴(yán)重并發(fā)癥(如急性尿潴留、膀胱結(jié)石、腎功能不全等)，甚至?xí)＜盎颊叩纳?］。有關(guān)良性前列腺增生的發(fā)病機(jī)制，目前尚不完全明了。近幾年，細(xì)胞凋亡在良性前列腺增生發(fā)病中的作用機(jī)制逐漸受到人們的重視，認(rèn)為良性前列腺增生是由于細(xì)胞凋亡減少，增殖增加，凋亡與增殖失衡所導(dǎo)致［4］。半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白酶-3(Caspase-3)是細(xì)胞凋亡的下游關(guān)鍵酶，Caspase-3在良性前列腺增生上皮表達(dá)下降，而在良性前列腺增生基質(zhì)中幾乎不表達(dá)，其表達(dá)異常與良性前列腺增生發(fā)生密切相關(guān)［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，caspase家族廣泛存在于細(xì)胞中，主要以酶原形式存在，一旦caspase被激活，細(xì)胞死亡將不可避免地出現(xiàn)。caspase-3是caspase家族中最重要的成員，大多數(shù)觸發(fā)細(xì)胞凋亡的因素，最終都需要通過(guò)caspase-3介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［7-8］。因此，干預(yù)caspase-3的表達(dá)在研究良性前列腺增生的防治中具有非常重要的意義［9］。

前列腺增生癥屬中醫(yī)學(xué)癃閉、淋證等范疇，腎虛血瘀為前列腺增生癥的基本病機(jī)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病乃因年老體弱，腎氣虧虛，氣化無(wú)力，瘀血停滯，或濕熱互結(jié)，阻于膀胱，水道不通所致。治宜標(biāo)本兼治，補(bǔ)腎益氣為治本，軟堅(jiān)消瘀、清熱利濕為治標(biāo)。益腎活血顆粒以補(bǔ)腎益氣、溫陽(yáng)利水、活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)為原則組方，在我院臨床應(yīng)用中取得了較好的療效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，益腎活血顆粒能減小前列腺質(zhì)量，降低前列腺指數(shù)。模型組大鼠前列腺指數(shù)明顯高于其他組，而益腎活血顆粒大劑量組PI明顯下降，鏡下見(jiàn)間質(zhì)結(jié)締組織增生明顯減少，說(shuō)明益腎活血顆粒具有較強(qiáng)抑制良性前列腺增生的作用。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)研究表明，模型組大鼠前列腺組織caspase-3表達(dá)明顯降低，而益腎活血顆粒大、小劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組中caspase-3的表達(dá)則明顯升高，益腎活血顆粒大劑量組caspase-3的表達(dá)也強(qiáng)于小劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組，益腎活血顆粒小劑量組caspase-3的表達(dá)強(qiáng)度接近陽(yáng)性對(duì)照組，二者無(wú)顯著性差異。作為陽(yáng)性對(duì)照藥的非那雄胺是治療良性前列腺增生的一線推薦用藥［10］，通過(guò)降低前列腺組織內(nèi)雙氫睪酮(DHT)濃度，間接降低進(jìn)入細(xì)胞核促使細(xì)胞增殖的信號(hào)水平，導(dǎo)致抑制細(xì)胞內(nèi)特異性生長(zhǎng)因子及其受體的表達(dá)，從而抑制前列腺細(xì)胞的增生［11］。近年來(lái)國(guó)外學(xué)者Bozec等［12］發(fā)現(xiàn)了非那雄胺可通過(guò)激活caspases-3和caspases-6而引發(fā)caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，增加前列腺細(xì)胞凋亡。本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)非那雄胺陽(yáng)性對(duì)照組中caspase-3的表達(dá)強(qiáng)于模型組(P＜0.01)，與益腎活血顆粒小劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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