譚玉柱，陳寶華，李敏，謝運(yùn)飛，趙高瓊，董小萍(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都611137)

川牛膝為莧科Amaranthaceae植物川牛膝Cyathula officinalis Kuan的干燥根。具有逐瘀通經(jīng)，通利關(guān)節(jié)，利尿通淋等功效［1］。生用以逐瘀通經(jīng)為主，酒炙后增強(qiáng)逐瘀、通利關(guān)節(jié)，鹽炙則增強(qiáng)利尿通淋［2］。植物甾酮類成分如蛻皮甾酮、牛膝甾酮、紅莧甾酮等多羥基甾體化合物是牛膝中的主要有效組分［3］。2010年版《中國(guó)藥典》以杯莧甾酮(C29H44O8)為指標(biāo)性成分，對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，規(guī)定按干燥品計(jì)算其含有量不得少于0.030%［1］。川牛膝為著名的川產(chǎn)地道藥材之一，既是常用中藥材，又是重要的出口品種。川牛膝主產(chǎn)于四川、云南、貴州，其中產(chǎn)量最大產(chǎn)區(qū)以四川雅安的寶興、天全、漢源縣和樂山金口河區(qū)為主［4］。而在這些產(chǎn)區(qū)中，受不同生長(zhǎng)環(huán)境和氣候的影響，川牛膝又有紅牛膝、白牛膝以及雜交牛膝3個(gè)變種。在重視祖國(guó)醫(yī)藥發(fā)展和西部大開發(fā)的今天，開發(fā)利用川牛膝也就顯得尤為重要?，F(xiàn)代對(duì)川牛膝已經(jīng)有了較為全面深入的研究，但針對(duì)川牛膝不同變種品質(zhì)評(píng)價(jià)的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)立足薄層色譜鑒別、特征指紋化學(xué)對(duì)比以及杯莧甾酮測(cè)定三方面，對(duì)其品質(zhì)進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，為合理、科學(xué)地開發(fā)利用川牛膝資源提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 藥材來源實(shí)驗(yàn)用川牛膝不同品種分別采自四川省雅安市，共計(jì)10批藥材，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)李敏教授鑒定為紅牛膝［即麻牛膝(頭序杯莧)Cyathula capitata(Wall.)Moq］、白牛膝(即川牛膝Cyathula officinalis Kuan)及雜交牛膝。藥材來源見表1。

表1 川牛膝不同品種藥材來源Tab.1 Sources of the different Cyathula officinalis Kuan

1.2 實(shí)驗(yàn)器材硅膠G板10 cm×20 cm(自制);杯莧甾酮(cyasterone)(成都普思生物科技有限公司，純度98%);Agilent 1200Series高效液相色譜儀，Agilent 1200 Series DAD檢測(cè)器，甲醇、乙腈均為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備取本品粉末2 g，加甲醇50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至約1 mL。加于中性氧化鋁柱(100～200目，2 g，內(nèi)徑為1 cm)上，用甲醇-乙酸乙酯(1∶1)40 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 杯莧甾酮對(duì)照品溶液配制取杯莧甾酮對(duì)照品加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.3 薄層色譜實(shí)驗(yàn)條件照薄層色譜法(2010年版《中國(guó)藥典》附錄ⅥB)試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，分別以A系統(tǒng)三氯甲烷-甲醇(10∶1)、B系統(tǒng)三氯甲烷-丙酮-甲酸(6∶2∶1)、C系統(tǒng)乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(1∶1∶0.5∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視，比較3種不同變種川牛膝顯色現(xiàn)象。

2.1.4 結(jié)果在不同展開體系下，不同變種川牛膝展開現(xiàn)象有顯著差別。如圖1所示，圖中川牛膝品種依次為:1.紅牛膝2.白牛膝3.雜交牛膝。

圖1 不同川牛膝TLC圖Fig.1 TLC chromatograms of Cyathula officinalis Kuan

2.2 特征指紋圖譜對(duì)照

2.2.1 供試品的制備取本品粉末(過三號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，搖勻，濾過，回收溶劑，殘?jiān)眉状级ㄈ葜? mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 色譜條件DiamonsilC-18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相A為0.1%磷酸水，流動(dòng)相B為乙腈，柱溫30℃，體積流量0.8 mL/min，λ=210 nm。

2.2.3 不同變種川牛膝化學(xué)成分比較參照川牛膝標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜研究結(jié)果［5］，鏡像定性比較3種川牛膝化學(xué)成分差異(見圖2)，由上至下依次為紅牛膝-白牛膝、紅牛膝-雜交牛膝、白牛膝-雜交牛膝。

2.3 杯莧甾酮測(cè)定

2.3.1 色譜條件DiamonsilC-18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為A(甲醇)-B(水)，按表2進(jìn)行梯度洗脫;體積流量1.0 mL/min;柱溫為30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)243 nm。理論板數(shù)按杯莧甾酮峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.3.2 方法與結(jié)果

2.3.2.1 供試品溶液制備取本品粉末(過三號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，搖勻，濾過，回收溶劑，殘?jiān)眉状级ㄈ葜?0 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

圖2 不同川牛膝鏡像圖Fig.2 Mirror symmetry of the different Cyathula officinalis Kuan

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution program

2.3.2.2 對(duì)照品溶液制備取杯莧甾酮對(duì)照品適量，精密稱定。加甲醇制成每1 mL含50 μg的對(duì)照品溶液。依選定的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。

2.3.2.3 線性關(guān)系考察取杯莧甾酮對(duì)照品適量，精密稱定。加甲醇制成每1 mL含50 μg的對(duì)照溶液。依選定的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積(Y)和進(jìn)樣體積(X)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=52.765X+160.5，r=0.999 6，線性范圍為0.204 4～1.022 μg。

2.3.2.4 精密度實(shí)驗(yàn)取川牛膝對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果杯莧甾酮的峰面積RSD為1.03%，表明儀器精密度良好。

2.3.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)取對(duì)照品溶液在0、4、8、12、24 h，分別進(jìn)樣10 μL，記錄杯莧甾酮峰面積。結(jié)果其峰面積RSD為2.37%，表明對(duì)照品在溶液中24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.2.6 重復(fù)性考察精密稱取6份同一品種川牛膝藥材粉末0.2 g，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定杯莧甾酮的峰面積，計(jì)算。結(jié)果同一品種的川牛膝杯莧甾酮RSD為1.09%。

2.3.2.7 加樣回收率試驗(yàn)精密取已知杯莧甾酮含有量的川牛膝樣品約2 g，共6份，分別加入等量的杯莧甾酮對(duì)照品，按供試品溶液制備項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，結(jié)果杯莧甾酮的平均回收率為101.9%;RSD為1.22%。

2.3.2.8 樣品測(cè)定分別精密稱取不同品種川牛膝藥材粉末各3份，每份各約1 g，按照供試品溶液制備項(xiàng)下處理。對(duì)照品與供試品分別進(jìn)樣10 μL，外標(biāo)法測(cè)定不同變種川牛膝藥材中杯莧甾酮，計(jì)算均值，結(jié)果見表3，圖3。

表3 杯莧甾酮測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.3 Determination of cyasterone(n=3)

圖3 對(duì)照品與樣品HPLC圖Fig.3 Chromatogram of reference substance and sample

3 結(jié)論

3.1 成分差異比較TLC圖顯示，A系統(tǒng)是參照2010年版《中國(guó)藥典》，結(jié)果顯示紅牛膝、白牛膝及雜交牛膝在原點(diǎn)處差異顯著，即后兩者均有黑色未展開斑點(diǎn)。B系統(tǒng)展開，結(jié)果顯示主要差異體現(xiàn)在Rf=0.23和Rf=0.58的粉紅斑點(diǎn)及黑色未展開斑點(diǎn)。C系統(tǒng)展開，黑色斑點(diǎn)尤為明顯，而在紅牛膝中未見此黑色斑點(diǎn)。

川牛膝化學(xué)成分對(duì)照顯示，不同品種牛膝化學(xué)成分差異較大。鏡像圖譜直觀顯示三者成分差異，即:紅牛膝與白牛膝成分差異主要體現(xiàn)在1、2、3、4區(qū)，紅牛膝與雜交牛膝成分差異主要體現(xiàn)在1、2、3區(qū)，白牛膝與雜交牛膝成分差異主要體現(xiàn)在1、2區(qū)。初步判定，三者差異成分主要體現(xiàn)在極性較大區(qū)段，這與TLC結(jié)果一致。

3.2 指標(biāo)性成分比較高效液相色譜測(cè)定不同變種川牛膝中指標(biāo)性成分杯莧甾酮，結(jié)果各川牛膝中杯莧甾酮含有量為白牛膝＞雜交牛膝＞紅牛膝。

4 討論

4.1 本研究中紅牛膝、白牛膝、雜交牛膝系道地藥材川牛膝不同變種，白牛膝與紅牛膝學(xué)名已有確定，而雜交牛膝學(xué)名目前還未明確命名。在川牛膝TLC研究中探索了石油醚-丙酮、石油醚-乙酸乙酯、三氯甲烷-丙酮、三氯甲烷-丙酮-甲酸、乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水等展開體系，最終確定本實(shí)驗(yàn)TLC展開條件。在顯色觀察中，作者分別紫外觀察、碘顯色、噴硫酸乙醇，結(jié)果顯示噴硫酸乙醇顯色效果明顯，差異顯著，并最終確定顯色條件。

4.2 化學(xué)成分表征結(jié)果顯示，不同變種川牛膝中白牛膝及雜交牛膝較紅牛膝化學(xué)成分復(fù)雜，主要差異集中體現(xiàn)在極性較大部位，而對(duì)于差異成分的分離鑒定有待進(jìn)一步研究;指標(biāo)性成分杯莧甾酮的比較顯示，白牛膝＞雜交牛膝＞紅牛膝。中藥材存在多來源、多品種情況，僅以指標(biāo)性成分的定性檢測(cè)與定量測(cè)定評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣缺乏科學(xué)依據(jù)，應(yīng)以生物評(píng)價(jià)為核心，感官評(píng)價(jià)和化學(xué)評(píng)價(jià)并重，同時(shí)建立基于“功效-毒性-物質(zhì)”的中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)的新型方法體系［6］，構(gòu)建面向臨床的中藥標(biāo)準(zhǔn)化［7］?；谥兴幩幚碜饔玫亩喑煞?、多靶點(diǎn)角度評(píng)價(jià)川牛膝品質(zhì)，本研究認(rèn)為白牛膝及雜交牛膝品質(zhì)優(yōu)于紅牛膝，這也與當(dāng)?shù)亓?xí)用經(jīng)驗(yàn)吻合。當(dāng)然，建立完善的中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)體系還應(yīng)進(jìn)行重金屬、農(nóng)殘限度檢查，從根本上規(guī)范藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證用藥安全、有效、可控。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:36.

［2］黎萬(wàn)壽，陳幸，李彬.正交法優(yōu)選鹽炙川牛膝最佳炮制工藝［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2005，16(12):18-19.

［3］鄭義哲，劉本.牛膝中植物甾酮類成分的研究進(jìn)展［J］.科技通報(bào)，2008，24(6):820.

［4］葉品良，彭娟，劉娟.川牛膝研究概況［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2007，35(2):52.

［5］譚玉柱，童婷婷，潘曉麗，等.川牛膝指紋圖譜研究［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，34(3):75-77.

［6］趙軍寧，鄢良春，宋軍，等.基于“功效-毒性-物質(zhì)”的新型中藥質(zhì)量控制模式的思路與方法［C］//第三屆中醫(yī)藥現(xiàn)代化國(guó)際科技大會(huì)學(xué)術(shù)委員會(huì)，中醫(yī)藥創(chuàng)新與發(fā)展，成都:四川科學(xué)技術(shù)出版社，2010.

［7］肖小河，王伽伯，鄢丹，等.面向臨床的中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究概況［C］//第三屆中醫(yī)藥現(xiàn)代化國(guó)際科技大會(huì)學(xué)術(shù)委員會(huì)，中醫(yī)藥創(chuàng)新與發(fā)展，成都:四川科學(xué)技術(shù)出版社，2010.