張?zhí)鹛?，周倩，吳曉文，孫立立

(山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟(jì)南250014)

艾葉為菊科植物艾Artemisia argyi Levl.et Vant.的干燥葉，為婦科常用藥。其味苦、辛，性溫有小毒。具有散寒止痛，溫經(jīng)止血的功效［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明，艾葉還可抗菌抗病毒、增強(qiáng)免疫，并具有對呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和對心血管系統(tǒng)多方面的作用［2-6］。艾葉有小毒，必須經(jīng)過炮制加工處理方能降低或消除毒副作用。艾葉歷代炮制方法包括炒、制炭、焙干、醋炙、糯米制、制絨、酒制、鹽炙等。沿用至今并被全國及各地炮制規(guī)范所收載的炮制方法主要為艾葉炭、醋艾葉和醋艾炭［7-9］?！吨袊幍洹?010年版僅收載了醋艾炭一種炮制規(guī)格，然而在現(xiàn)代應(yīng)用中醋制法應(yīng)用也比較多［10-11］，但目前缺乏對醋艾葉炮制工藝相關(guān)研究。1988年版《全國中藥炮制規(guī)范》［7］中僅規(guī)定了用醋量，無具體工藝參數(shù)。為優(yōu)化和規(guī)范其炮制工藝，本實(shí)驗(yàn)對醋艾葉的炮制工藝進(jìn)行了優(yōu)選，以保證醋艾葉飲片的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器十萬分之一電子天平(Sartorius R200D，德國);島津UV—265FM紫外分光光度計(jì);B3200S—T超聲機(jī)(必能信超聲有限公司，250F，50 Hz)，中藥炮制控溫爐(哈爾濱測電器廠)。YXQG02型電熱式提取罐;RE—2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試藥與試劑艾葉(產(chǎn)地安徽，購自安徽滬譙中藥飲片廠)，經(jīng)本院李英霞研究員鑒定為《中國藥典》收載品種。蘆丁對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，批號100080-200306);乙醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁等均為分析純。輔料醋為龍門米醋(北京王致和味滋康食品有限公司)。

2 正交試驗(yàn)法優(yōu)選醋艾葉炮制工藝

2.1 因素水平設(shè)計(jì)采用L9(34)正交試驗(yàn)對影響醋艾葉飲片質(zhì)量主要因素(加醋量、炒炙溫度與炒炙時間)進(jìn)行考察，優(yōu)選最佳醋炙工藝，具體設(shè)計(jì)見表1。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

2.2 試驗(yàn)方法照正交設(shè)計(jì)方案，取一定量輔料醋，與適量水混勻后，加入到50 g凈艾葉飲片中拌勻，悶潤，置中藥炮制控溫爐中，照設(shè)定溫度和時間進(jìn)行炮制，取出晾涼，即得。

2.3 考察指標(biāo)及指標(biāo)選擇依據(jù)

2.3.1 傳統(tǒng)質(zhì)量評價指標(biāo)的選擇依據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)飲片的傳統(tǒng)質(zhì)量評價是以飲片外觀性狀為主要指標(biāo)，是中醫(yī)藥寶貴經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，可在相當(dāng)程度上提示飲片質(zhì)量。

外觀性狀評分標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)《全國中藥炮制規(guī)范》對醋艾葉的性狀要求，邀請老藥工通過審查醋艾葉的表面顏色(滿分40分)、著色均勻情況(滿分30分)、有無醋氣(滿分30分)等進(jìn)行打分，計(jì)算三項(xiàng)得分總和。

2.3.2 內(nèi)在質(zhì)量評價指標(biāo)的選擇依據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)黃酮是艾葉的主要成分［12-13］，且是主要有效成分之一。因此選用總黃酮含有量作內(nèi)在質(zhì)量評價指標(biāo)。2.3.2.1對照品溶液的制備取120℃干燥至恒定質(zhì)量的蘆丁對照品約28 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，搖勻。精密量取20 mL，置50 mL量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得(每mL含蘆丁0.225 mg)。

2.3.2.2 供試品溶液制備取醋艾葉樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，精密加入40%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，回流提取1 h，放涼，稱定質(zhì)量，用40%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2.3 方法學(xué)考察

測定波長的選擇分別對對照品溶液和供試品溶液進(jìn)行波長掃描，結(jié)果在504 nm處有最大吸收。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，分別置25 mL量瓶中，各加入40%乙醇至6 mL，然后分別加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min;加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min;加入1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL，加40%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，于504 nm處測定吸光度。以對照品質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得回歸方程為A=9.514 3C+0.038 1，r=0.999 9。表明蘆丁在0.009～0.054 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)精密吸取對照品溶液4 mL，供試品溶液1 mL，分別照上述方法連續(xù)測定6次。結(jié)果，對照品溶液及供試品溶液吸光度的RSD分別為0.13%和0.11%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取蘆丁對照品溶液4 mL，供試品溶液1 mL，分別于10、20、30、40、50、60 min測定。結(jié)果，對照品和供試品溶液在60 min內(nèi)均穩(wěn)定性良好，RSD均小于3%。

重復(fù)性試驗(yàn)取艾葉粉末6份，分別照上述方法制備供試品溶液，并依法進(jìn)行測定，結(jié)果測得總黃酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.02%，RSD為1.2%。說明本法重復(fù)性良好。

回收率試驗(yàn)采用加樣回收法試驗(yàn)。取含有量已知的艾葉樣品粉末6份，每份約0.25 g，在每份樣品中精密加入蘆丁對照品適量，依法制備供試品溶液進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2，結(jié)果表明該測定方法回收率良好。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests

綜上，該方法測定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，可作為艾葉總黃酮的定量測定方法。

2.3.3 綜合評分標(biāo)準(zhǔn)以綜合加權(quán)評分的方法對各炮制品進(jìn)行評價，兩指標(biāo)加權(quán)系數(shù)分別為0.5。計(jì)算方法如下:綜合評分=(樣品性狀得分×50/9份樣品最高分)+(樣品總黃酮含有量×50/9份樣品最高含有量);以綜合評分為評價指標(biāo)，對結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果見表3和表4。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算表Tab.3 Results of orthogonal tests

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

2.4 結(jié)果分析直觀分析:由極差(R)可以看出:對綜合評分影響大小依次為B＞A＞C。其中A因素＞＞，B因素＞＞，C因素＞＞。

方差分析:A、B和C因素均對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響。

綜合直觀分析和方差分析結(jié)果，將醋艾葉最佳炮制工藝確定為A2B2C3，即取輔料醋，每100 g艾葉加醋15 g，與適量水混勻后，加入到凈艾葉飲片中拌勻，悶潤，220℃炒制28 min，取出，晾涼。

3 工藝驗(yàn)證

取生艾葉飲片(每份500 g)，照確定的最佳工藝參數(shù)制備醋艾葉飲片，對其進(jìn)行性狀評分和總黃酮測定，結(jié)果見表5。

表5 驗(yàn)證結(jié)果Tab.5 Results of confirmatory experiment

由表5可見，制備得到的醋艾葉飲片性狀均符合要求，總黃酮含量RSD小于3%，表明該工藝穩(wěn)定可行，得到的成品質(zhì)量穩(wěn)定。

4 毒性比較

艾葉醋炙的目的為降低毒性，保證臨床用藥安全。實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)艾葉毒性部位為揮發(fā)油和甲醇提取部位，為驗(yàn)證優(yōu)選的工藝是否達(dá)到了減毒的目的，分別提取生、醋艾葉揮發(fā)油和甲醇部位，進(jìn)行了急性毒性比較研究。

4.1 動物及條件昆明種SPF級小鼠(20±2)g，雌雄各半，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心供應(yīng)，許可證號:SCXK(魯)20090001。實(shí)驗(yàn)環(huán)境:山東省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號:SYXK(魯)20050052，SPF級。

4.2 飲片提取物制備揮發(fā)油:照《中國藥典》2010年版一部附錄ⅩD揮發(fā)油測定法甲法提取揮發(fā)油，用時以玉米油稀釋。

甲醇提取部位:采用索氏提取法，石油醚脫脂、并用乙酸乙酯提取后，棄去提取液，藥渣揮干溶劑，用甲醇進(jìn)行提取和富集，作為甲醇提取部位，用時以1%CMC-Na混懸，濃度均以生藥計(jì)算。

4.3 試驗(yàn)方法照急性毒性試驗(yàn)要求先進(jìn)行急性毒性預(yù)試驗(yàn)，確定生、醋艾葉油致小鼠100%死亡的最小劑量，初步摸索r值，然后設(shè)計(jì)不同劑量組進(jìn)行試驗(yàn)。采用孫瑞元等制定的新藥最新統(tǒng)計(jì)軟件Ver1.0DAS Bliss計(jì)算LD50。

4.3.1 艾葉及醋艾葉揮發(fā)油毒性比較預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，生艾葉油致小鼠100%死亡的最小劑量為5.24 mL/kg，醋艾葉為20.00 mL/kg，以此為據(jù)，分別設(shè)計(jì)6個劑量組，進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果見表6。

表6 揮發(fā)油部位試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Results of volatile oil fraction

通過統(tǒng)計(jì)，生艾葉油LD50=2.62 mL/kg，95%的可信度區(qū)間為2.30～2.99 mL/kg。醋艾葉油LD50=9.43 mL/kg，95%的可信度區(qū)間為7.74～11.5 mL/kg。

4.3.2 艾葉與醋艾葉甲醇部位急性毒性比較預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，生艾葉甲醇部位致小鼠100%死亡的最小劑量為216 g/kg。醋艾葉甲醇部位以1%CMC-Na混懸至最大質(zhì)量濃度4.8g/mL，ig給藥0.4 mL/10 g，未發(fā)現(xiàn)小鼠死亡。結(jié)果見表7。

表7 甲醇部位試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Results of methanol fraction

通過統(tǒng)計(jì)，生艾葉甲醇部位LD50=157.5 g/kg，95%的可信度區(qū)間為140.7～176.3 g/kg。醋艾葉甲醇部位未見毒性。

4.4 結(jié)果通過急性毒性試驗(yàn)比較，可見采用本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選工藝制備的醋艾葉與生艾葉相比，揮發(fā)油部位毒性明顯降低，甲醇部位醋品未見毒性。

5 小結(jié)與討論

采用綜合評分法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，可以兼顧到傳統(tǒng)質(zhì)量評價和內(nèi)在質(zhì)量評價雙重指標(biāo)，能夠更加客觀全面的反映各因素水平對醋艾葉質(zhì)量的影響。經(jīng)過試驗(yàn)，在加醋量、炒炙溫度和炒炙時間方面確定了具體參數(shù)，具體為:取輔料醋(每100 g艾葉加醋15 g)，與適量水混勻后，加入到凈艾葉飲片中拌勻，悶潤，220℃炒制28 min，取出，晾涼。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)選的醋艾葉炮制工藝穩(wěn)定可行。

急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，艾葉經(jīng)醋炙后，其毒性明顯降低，表明確定的炮制工藝制備的醋艾葉可明顯降低艾葉毒性，達(dá)到了炮制減毒的目的，

本實(shí)驗(yàn)可規(guī)范醋艾葉的炮制工藝，保證醋艾葉飲片的質(zhì)量以及臨床用藥安全有效。

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