許良，李英豪，包呼和牧區(qū)樂，劉景林

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028042)

多年的蒙醫(yī)臨床實(shí)踐證明蒙藥查干-掃日老-4湯是具有清熱，止咳，祛痰、緩解胸背刺痛等功效的有效方劑。查干-掃日老-4湯由甘草、北沙參、拳參、紫草茸等四味中藥組成［1］的散劑。近年來文獻(xiàn)報(bào)道，該藥具有防治小兒呼吸道感染作用［2］。該蒙藥的薄層鑒別法［3］已有報(bào)道。槲皮素為處方中拳參的主要藥效成分之一，具有抗炎、抗過敏、抗胃潰瘍、利尿、抗感染、抗腫瘤、抗病毒作用，具有較好的祛痰、止咳、平喘作用［4］。甘草苷為處方中甘草的代表性黃酮類活性成分之一。因此，本實(shí)驗(yàn)擬建立同時(shí)測定蒙藥查干-掃日老-4湯中2種指標(biāo)成分的反相高效液相色譜法［6-15］，以便為該制劑的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Waters 600E泵，2996二級(jí)管陣列檢測器(DAD)Waters Empower工作站;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)公司)。

1.2 試藥甲醇(色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);蒸餾水(自制);乙腈(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑沈陽有限公司);無水乙醇(天津市天力化學(xué)試劑有限公司);槲皮素對照品、甘草苷對照品(均購自中國藥品生物制品檢定所);查干-掃日老-4湯(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室，批號(hào):20100130、20100512、20100620、20100704)。

2 溶液的制備

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)樣品2.8 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得含槲皮素質(zhì)量濃度為0.28 mg/mL的對照品溶液。

精密稱取甘草苷標(biāo)準(zhǔn)樣品2.5 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得含甘草苷質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備精密稱取蒙藥查干-掃日老-4湯1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇20 mL，經(jīng)超聲處理35 min，冷卻，過濾，在25 mL量瓶中定容。得濃度為0.04 g/mL的查干-掃日老-4湯溶液，進(jìn)樣時(shí)經(jīng)0.22 μm微孔濾膜做過濾處理。

3 色譜條件

色譜柱為symmetry C18(250 mm×5.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(35∶65);體積流量為0.8 mL/min，柱溫25℃;檢測波長273 nm;進(jìn)樣量10 μL。

4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

理論塔板數(shù)按槲皮素計(jì)算不低于4 600，按甘草苷計(jì)算不低于4 700，槲皮素與其他組分實(shí)現(xiàn)完全分離，甘草苷的分離度大于1.6，在以上色譜條件下，槲皮素對照品，甘草苷對照品，查干-掃日老-4湯供試品和陰性樣品的色譜圖見圖1。

圖1 甘草苷和槲皮素RP-HPLC色譜圖Fig.1 RP-HPLC chromatograms of liquiritin and quercetin

5 線性關(guān)系考察

在上述色譜條件下，精密量取槲皮素對照品溶液2.0、6.0、10.0、16.0、20.0 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。得回歸方程Y=881 367X+295 343，R=0.999 9。表明槲皮素在0.56～5.6 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。精密量取甘草苷對照品溶液2.0、6.0、10.0、16.0、20.0 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。得回歸方程Y=278 966X+78554 ，R=0.999 8，表明甘草苷在0.50～5.0 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

6 重復(fù)性與穩(wěn)定性試驗(yàn)

6.1 重復(fù)性試驗(yàn)取同一供試品溶液(批號(hào):20100130)查干-掃日老-4湯，按2.2項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備5份供試品溶液，分別測定，結(jié)果槲皮素和甘草苷的RSD分別為1.57%和1.89%，表明重復(fù)性較好。

6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液查干-掃日老-4湯(批號(hào):20100130)，按上述色譜條件，分別在l、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測定供試品溶液中槲皮素和甘草苷的RSD為1.68%和1.77%，表明槲皮素和甘草苷至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

7 精密度試驗(yàn)

精密吸取槲皮素(0.25 mg/mL)和甘草苷(0.28 mg/mL)對照品溶液，分別重復(fù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣5 μL，結(jié)果槲皮素峰面積RSD為1.35%，甘草苷峰面積RSD為1.45%的表明該方法精密度良好。

8 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含有量的查干-掃日老-4湯樣品(批號(hào):20100130)0.500 0 g共6份，置于25 mL量瓶中，分別加入一定質(zhì)量濃度的槲皮素和甘草苷對照品溶液1 mL，照2.2項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備樣品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍，按一定比例稀釋，在上述色譜條件下測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 槲皮素和甘草苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests of quercetin and liguiritin(n=6)

9 樣品測定

分別精密稱取3份樣品各1.000 0 g。按2.2項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備溶液，稀釋，精密吸取供試品溶液10 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定。計(jì)算槲皮素和甘草苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果(n=6)Tab.2 Results of sample determination(n=6)

10 討論

10.1 供試品制備過程中，考察了回流提取法和超聲提取法對樣品中槲皮素和甘草苷提取率以及色譜分離度的影響。結(jié)果表明，超聲提取法的提取率高于回流提取法，同時(shí)前者有利于改善被測組分色譜分離度。此外，超聲提取法有著提取效率高、時(shí)間短、節(jié)約能源等有點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取法制備樣品。

10.2 等度洗脫就可以達(dá)到樣品被測組分的分離目的。溫度變化對被測組分的保留時(shí)間無影響，實(shí)驗(yàn)在室溫條件下進(jìn)行。流動(dòng)相比例為乙腈-水(35∶65)時(shí)被測兩組分的保留時(shí)間適宜，被測組分色譜峰對稱，無需在流動(dòng)相中加入色譜峰改型劑，色譜分離度滿足要求。

［1］內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生廳，內(nèi)蒙古蒙成藥標(biāo)準(zhǔn)［S］.赤峰:內(nèi)蒙古科學(xué)技術(shù)出版社，1984.

［2］韓春平，王青虎，敖日布.蒙成藥查干-掃日勞-4湯的薄層色譜鑒別研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，1999，10(11):835-836.

［3］紅梅，德欽.蒙藥查干掃日老-4湯治療小兒支氣管炎［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2009，8(8):76.

［4］歐明，林勵(lì)，李衍文.簡明中藥成分手冊［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2003:379.

［5］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

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［7］靳鳳云，賀祝英，趙楊，等.HPLC測定華蓋散傳統(tǒng)湯劑與顆粒湯劑中鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、甘草酸、甘草苷的含量［J］.中成藥，2008，30(1):80-86.

［8］王春麗，張學(xué)蘭.HPLC測定蓮房不同炮制品中金絲桃苷和槲皮素的含量［J］.中成藥，2010，32(10):1729-1733.

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