王瑩，王青，張偉東，王鵬遠(yuǎn)，顧宜，王曉娟*

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西咸陽(yáng)712046;2.第四軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科，陜西西安710032)

決明子Cassiae Semen，又名草決明，為豆科植物決明Cassia obtusifolia L.或小決明Cassia tora L.的干燥成熟種子，全國(guó)大部分地區(qū)都有栽培，主產(chǎn)安徽、廣西、浙江和四川等地。其味甘、苦、咸，性微寒，歸肝、腎、大腸經(jīng)，具有清肝明目、潤(rùn)腸通便之功效。主治目赤澀痛，羞明多淚，頭痛眩暈，目暗不明，大便秘結(jié)［1］。目前研究報(bào)道的決明子提取方法主要是以大黃酚或大黃素的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行研究［2-4］，未見(jiàn)同時(shí)以游離蒽醌、蒽醌苷類(lèi)含有量為指標(biāo)的研究。由于大黃酚或大黃素作為評(píng)價(jià)指標(biāo)的局限性，本實(shí)驗(yàn)以橙黃決明素、大黃酸、黃決明素、決明素、蘆薈大黃素、1-去甲基決明素、大黃酚、大黃素甲醚8種游離蒽醌，決明子苷、2-葡萄糖基橙黃決明素、2-葡萄糖基決明素、2-葡萄糖基黃決明素4種蒽醌苷類(lèi)及12種蒽醌總含有量為評(píng)判指標(biāo)來(lái)篩選決明子藥材的最佳提取方法，為決明子中蒽醌類(lèi)成分提取的樣品處理方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器LC—2010A高效液相色譜儀(日本島津制作所);DL—720超聲儀(浙江石浦海天電子儀器廠(chǎng));BT125D分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥決明子購(gòu)自湖北荊州(經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院雷國(guó)蓮教授鑒定為豆科植物決明Cassia obtusifolia L.的干燥成熟種子);對(duì)照品決明子苷、2-葡萄糖基橙黃決明素、2-葡萄糖基決明素、2-葡萄糖黃決明素、橙黃決明素、大黃酸、黃決明素、決明素、蘆薈大黃素、大黃酚、1-去甲基決明素、大黃素甲醚購(gòu)自西安昊軒生物科技有限公司(純度均大于98%);乙腈、甲醇(色譜純，美國(guó)Fisher公司)，水為實(shí)驗(yàn)室自制三蒸水;其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［5-7］Diamonsil C18(2)柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈－0.1%甲酸水溶液梯度洗脫;體積流量1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm;柱溫25℃;進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Program of gradient elution

2.2 混合對(duì)照品溶液的配制分別精密稱(chēng)取決明子苷2.64 mg、2-葡萄糖基橙黃決明素1.80 mg、2-葡萄糖基決明素2.02 mg、2-葡萄糖基黃決明素2.08 mg、橙黃決明素2.16 mg、大黃酸1.94 mg、黃決明素2.06 mg、決明素2.02 mg、蘆薈大黃素1.00 mg、1-去甲基決明素1.98 mg、大黃酚2.44 mg及大黃素甲醚2.95 mg至10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即為對(duì)照品貯備溶液。

分別精密量取上述對(duì)照品貯備溶液2.5、4.0、1.0、1.5、3.0、5.0、0.5、0.5、2.0、0.5、0.5、0.5 mL于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即為混合對(duì)照品貯備液。各對(duì)照品的質(zhì)量濃度分別為決明子苷26.4 μg/mL、2-葡萄糖基橙黃決明素28.8 μg/mL、2-葡萄糖基決明素8.08 μg/mL、2-葡萄糖基黃決明素12.48 μg/mL、橙黃決明素25.92 μg/mL、大黃酸38.8 μg/mL、黃決明素4.12 μg/mL、決明素4.04 μg/mL、蘆薈大黃素8.0 μg/mL、1-去甲基決明素3.96 μg/mL、大黃酚4.88 μg/mL、大黃素甲醚5.9 μg/mL。

2.3 供試品溶液的制備取決明子藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.5 g，精密稱(chēng)定。置圓底燒瓶中，按正交設(shè)計(jì)的9種工藝進(jìn)行回流提取，過(guò)濾，合并濾液至50 mL量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品(A)，決明子(B)的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of 12 reference substances(A)and sample of Cassiae Semen(B)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制精密吸取上述混合對(duì)照品貯備液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。分別過(guò)0.45 μm微孔濾膜，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，色譜圖見(jiàn)圖1。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，各對(duì)應(yīng)指標(biāo)成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得其回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照品貯備液稀釋5倍后的溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果決明子苷、2-葡萄糖基橙黃決明素、2-葡萄糖基決明素、2-葡萄糖黃決明素、橙黃決明素、大黃酸、黃決明素、決明素、蘆薈大黃素、1-去甲基決明素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.58%、0.50%、0.93%、0.29%、0.61%、0.30%、0.94%、0.82%、0.75%、0.62%、0.39%、0.23%。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液(試驗(yàn)號(hào):1)，按2.1項(xiàng)下的色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果決明子苷、2-葡萄糖基橙黃決明素、2-葡萄糖基決明素、2-葡萄糖黃決明素、橙黃決明素、大黃酸、黃決明素、決明素、蘆薈大黃素、1-去甲基決明素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.58%、0.98%、0.47%、0.55%、0.71%、0.73%、0.52%、0.96%、0.69%、0.74%、0.91%、0.90%。

表2 12個(gè)對(duì)照品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線(xiàn)性范圍Tab.2 Regression equations，correlation coefficients and linearity ranges of the 12 reference substances

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密稱(chēng)取決明子藥材粉末0.5 g(試驗(yàn)號(hào):1)，平行6份，制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果決明子苷、2-葡萄糖基橙黃決明素、2-葡萄糖基決明素、2-葡萄糖黃決明素、橙黃決明素、大黃酸、黃決明素、決明素、蘆薈大黃素、1-去甲基決明素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.27%、0.61%、0.46%、0.92%、0.79%、0.73%、0.68%、0.80%、0.68%、0.34%、0.74%、0.77%。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)取已知量的決明子藥材粉末6份(試驗(yàn)號(hào):1)，每份約0.25 g，精密稱(chēng)定。分別精密加入決明子苷、2-葡萄糖基橙黃決明素、2-葡萄糖基決明素、2-葡萄糖黃決明素、橙黃決明素、大黃酸、黃決明素、決明素、蘆薈大黃素、1-去甲基決明素、大黃酚、大黃素甲醚的對(duì)照品貯備液各2.0、3.0、0.3、0.7、2.0、3.0、0.3、0.1、0.5、0.2、0.3、0.1 mL，制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果決明子苷、2-葡萄糖基橙黃決明素、2-葡萄糖基決明素、2-葡萄糖黃決明素、橙黃決明素、大黃酸、黃決明素、決明素、蘆薈大黃素、1-去甲基決明素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率分別為100.53%、101.22%、99.11%、102.56%、100.90%、99.73%、98.25%、101.11%、98.23%、96.41%、101.56%、100.67%，RSD分別為1.79%、2.08%、1.33%、1.97%、1.18%、1.81%、1.87%、2.31%、1.71%、2.61%、1.46%、2.05%。

2.9 正交試驗(yàn)與結(jié)果根據(jù)單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取影響提取工藝的主要因素乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、提取時(shí)間(B)、溶劑倍量(C)和提取次數(shù)(D)進(jìn)行L9(34)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表3。

表3 因素水平Tab.3 Factors and levels

以游離蒽醌、蒽醌苷類(lèi)及12種蒽醌總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，選用L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果及方差分析見(jiàn)表4、5。由極差分析結(jié)果可知，影響游離蒽醌提取因素的重要性為A＞C＞B＞D;蒽醌苷類(lèi)為A＞B＞C＞D;總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為A＞B＞D＞C，且三者中因素A均具有顯著性差異，因素B只在總質(zhì)量分?jǐn)?shù)提取時(shí)有顯著性差異，而因素C、D均無(wú)顯著性差異，對(duì)蒽醌類(lèi)成分的提取影響較小。綜合以上分析結(jié)果，最佳提取方法為A2B3C1D2或A2B3C1D1，從實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便性和成本方面考慮，最終確定決明子中蒽醌類(lèi)成分的最佳提取方法為A2B3C1D1，即50倍70%的乙醇回流提取1次，提取時(shí)間2 h。

2.10 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)精密稱(chēng)取決明子粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.5 g共6份，按照上述優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行提取。按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫系統(tǒng)對(duì)各種成分的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫時(shí)，12種蒽醌類(lèi)化合物可以達(dá)到完全分離，可準(zhǔn)確定量。

預(yù)實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了甲醇，乙醇作為溶劑，超聲提取，回流提取對(duì)提取工藝的影響，最終確定用乙醇回流提取做正交試驗(yàn)。通過(guò)正交試驗(yàn)和方差分析可知乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間為主要影響因素，最佳提取方法為A2B3C1D2或A2B3C1D1，因素D不具有顯著性差異，從實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便性和成本方面考慮，提取次數(shù)選為1次。固液比50倍為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的最低倍量，同時(shí)也考慮了更低倍量的溶劑，結(jié)果顯示50倍量提取效果依然最佳。故最終確定決明子蒽醌類(lèi)的提取工藝為A2B3C1D1，即50倍量70%的乙醇提取1次，提取時(shí)間2 h。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of orthogonal test

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

按優(yōu)選的提取工藝A2B3C1D1進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得6次實(shí)驗(yàn)的游離蒽醌、蒽醌苷類(lèi)及12種蒽醌總含有量的RSD分別為0.72%，0.66%，0.57%，說(shuō)明該提取方法穩(wěn)定、重復(fù)性好。多年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者在決明子的化學(xué)成分方面做了大量研究，結(jié)果表明，決明子中含蒽醌類(lèi)、萘駢吡喃酮類(lèi)、脂肪酸類(lèi)、氨基酸和無(wú)機(jī)元素等，主要有效成分為蒽醌類(lèi)［8］，決明子中蒽醌類(lèi)成分多種多樣，單一的評(píng)價(jià)指標(biāo)不能全面準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)提取方法。本實(shí)驗(yàn)采用多指標(biāo)成分定量分析優(yōu)選決明子提取方法，為決明子藥材研究中樣品處理過(guò)程提供了更全面、科學(xué)、高效的方法。

表6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.6 Verifying test results(n=6)

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