陳春輝

(九江市第三人民醫(yī)院檢驗科，江西 九江 332000)

探針熔解分析法快速檢測結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變

陳春輝

(九江市第三人民醫(yī)院檢驗科，江西 九江 332000)

目的對采用探針熔解分析法對結(jié)核分枝桿菌的鏈霉素耐藥突變情況進(jìn)行快速檢測的應(yīng)用價值進(jìn)行研究分析。方法抽取740株結(jié)核分枝桿菌的臨床分離菌株，采用探針熔解分析法，對鏈霉素耐藥突變情況進(jìn)行檢測。結(jié)果740株結(jié)核分枝桿菌中有86株發(fā)生突變，9份標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)雜合信號，8份標(biāo)本中沒有任何信號。29份存在藥敏性的標(biāo)本的檢測結(jié)果均顯示為野生型，有耐藥性的13份標(biāo)本中僅有5份存在突變現(xiàn)象，另外的8份標(biāo)本檢測結(jié)果顯示為野生型。結(jié)論采用探針熔解分析法對結(jié)核分枝桿菌的鏈霉素耐藥突變情況進(jìn)行快速檢測，其特異性非常明顯，且具有快速、準(zhǔn)確的特點。

探針熔解分析法；結(jié)核分枝桿菌；鏈霉素；耐藥突變

為了對采用探針熔解分析法對結(jié)核分枝桿菌的鏈霉素耐藥突變情況進(jìn)行快速檢測的應(yīng)用價值進(jìn)行研究分析，使臨床對對結(jié)核分枝桿菌的鏈霉素耐藥突變情況有更加全面的了解，為臨床提供對對結(jié)核分枝桿菌的鏈霉素耐藥突變情況進(jìn)行檢驗的有效方法，使該項檢測方法在臨床上得到進(jìn)一步的普及和應(yīng)用，我們組織進(jìn)行了本次研究。在研究的整個過程中，我們抽取740株結(jié)核分枝桿菌的臨床分離菌株，采用探針熔解分析法，對鏈霉素耐藥突變情況進(jìn)行檢測?，F(xiàn)將分析結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

抽取在2008年5月至2011年5月這三年時間內(nèi)收集的740株結(jié)核分枝桿菌的臨床分離菌株。野生型標(biāo)本選用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株，標(biāo)準(zhǔn)菌株盤采用特異性實驗所用的包含37株非結(jié)核分枝桿菌的標(biāo)準(zhǔn)盤。

1.2 儀器

我院現(xiàn)有的普通PCR儀和實時PCR儀。

1.3 方法

采用試劑盒中所提供的提取液制備所需的PCR擴(kuò)增模板。具體的步驟包括以下幾點:用接種環(huán)對固體培養(yǎng)基上的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行收集，使其懸于劑量為300μL提取液中。取1mL液體液體培養(yǎng)基上的結(jié)核分枝桿菌，在10000r/min的條件下進(jìn)行離心處理15min左右，將上清丟棄后在300μL的提取液中對細(xì)菌進(jìn)行重懸處理。采用封口膜進(jìn)行封口，99℃條件下加熱處理20min左右，然后在14000r/min條件下離心處理10min左右，將上清液移至1.5mL的離心管內(nèi)。即為PCR的擴(kuò)增模板，要采用紫外檢測方法對模板的濃度進(jìn)行定量，結(jié)核桿菌含量在103拷貝/μL以上。使用之前在-20攝氏度環(huán)境中保存[1]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在本次研究過程中所得到的所有相關(guān)數(shù)據(jù)，均采用SPSS14.0統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行處理分析，P＜0.05時認(rèn)為有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

經(jīng)過仔細(xì)研究后我們發(fā)現(xiàn)，740株結(jié)核分枝桿菌中有86株發(fā)生突變，9份標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)雜合信號，8份標(biāo)本中沒有任何信號。29份存在藥敏性的標(biāo)本的檢測結(jié)果均顯示為野生型，有耐藥性的13份標(biāo)本中僅有5份存在突變現(xiàn)象，另外的8份標(biāo)本檢測結(jié)果顯示為野生型。

3 討 論

常規(guī)的一些抗結(jié)核類藥物是目前臨床對患有結(jié)核病的患者進(jìn)行化學(xué)藥物治療的一個基本方法，而對該類采用化學(xué)藥物進(jìn)行治療是對目前我們對結(jié)核病進(jìn)行有效控制的一種非常重要的手段。鏈霉素是在上個世紀(jì)的40年代被醫(yī)學(xué)界所發(fā)現(xiàn)的，是截止到目前為止，臨床上公認(rèn)的出現(xiàn)最早的對結(jié)核患者進(jìn)行治療的藥物，同時該藥物也是目前對患有結(jié)核病的患者進(jìn)行治療一種常規(guī)藥物。鏈霉素是一種比較常見的氨基環(huán)醇糖苷類抗生素藥物，該藥物在服用后主要會對結(jié)核分枝桿菌的核糖體產(chǎn)生作用，與核糖體上的30S亞單位發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)，誘導(dǎo)相關(guān)的遺傳密碼產(chǎn)生錯配效應(yīng)，對mRNA翻譯整個進(jìn)行過程產(chǎn)生一定的抑制效果，對翻譯的校對過程也具有一定的干擾效果，從而對整個蛋白質(zhì)合成過程進(jìn)行有效抑制。鏈霉素在臨床對結(jié)核病患者進(jìn)行治療的過程中，通常采用單獨給藥方式，因此該藥物的耐藥性的發(fā)展速度非?？臁?/p>

由于貧困、艾滋病、人口流動過快和機(jī)體耐藥等因素的影響，目前全球范圍內(nèi)結(jié)核病的發(fā)病率和病死率正呈現(xiàn)出一種快速回升的發(fā)展態(tài)勢，已經(jīng)成為了臨床上與艾滋病對人類具有同等危害性的全球性的最危險的一種傳染病。由于結(jié)核分枝桿菌的生長速度比較緩慢，經(jīng)增菌培養(yǎng)處理后再進(jìn)行藥物敏感性試驗，通常情況下需要6周左右的時間，因此，對臨床上常見的一些自身具有非常強(qiáng)的耐藥結(jié)核病的患者進(jìn)行治療的過程中，無法提供一些更加及時的指導(dǎo)，使臨床實際治療過程中的需要很難得到充分的滿足，因此盡快找到一種對結(jié)核分枝桿菌的耐藥性進(jìn)行快速檢測的實驗方法是一個亟待解決的問題。近年來，通過不斷地研究已經(jīng)找到了一些能夠分子的水平對基因突變的具體情況進(jìn)行準(zhǔn)確檢測的方法，例如單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法（SSCP），限制性片段長度多態(tài)性分析法（RFLP），DNA測序法，線性探針雜交法等，這些方法與前面所說的培養(yǎng)方法相比較，這些方法的檢測速度更快，能夠一定程度上使檢出率和通量得到提高，但是均需要進(jìn)行PCR后處理， 這不僅會對檢測的效率造成一定的影響，更容易將已經(jīng)擴(kuò)增的產(chǎn)物污染，而且在操作過程中的難度也會隨之加大，對實驗室的儀器設(shè)備的實際要求會非常高。從這一點來講，實時熒光PCR技術(shù)所具有的優(yōu)勢就非常明顯。首先，進(jìn)行實時擴(kuò)增處理時的檢測優(yōu)勢會相對更大一些，可以從根本上進(jìn)一步縮短檢測所需要的時間。在本次實驗研究進(jìn)行的整個過程中，對單個的樣品進(jìn)行檢測所需的時間僅為2h左右;省去了PCR的后處理的相關(guān)步驟，進(jìn)而進(jìn)一步降低了樣品在檢測過程中被污染的機(jī)會;同時還有PCR的高效、快捷、簡便、經(jīng)濟(jì)等一系列優(yōu)點，可以對結(jié)核分枝桿菌的鏈霉素耐藥的突變情況的多個相關(guān)基因進(jìn)行檢測，適用于臨床對大批量的菌株進(jìn)行篩查[2]。

總而言之，采用探針熔解分析法對結(jié)核分枝桿菌的鏈霉素耐藥突變情況進(jìn)行快速檢測，其特異性非常明顯，且具有快速、準(zhǔn)確的特點，可以將該項檢測技術(shù)直接應(yīng)用于臨床檢測過程中。

[1]王超,朱中元.抗結(jié)核病藥物的研究進(jìn)展[J].中國熱帶醫(yī)學(xué),2008,18(14):674-675.

[2]王甦民.應(yīng)重視結(jié)核病的實驗診斷[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志,2005,28(18):769-770.

R378.91+1

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1671-8194（2012）14-0088-02