張燕 張俐 牛素生 劉俊寧

福建中醫(yī)藥大學骨傷學院，福建福州 350108

骨肉瘤化療耐藥機制及逆轉治療的研究進展

張燕 張俐 牛素生 劉俊寧

福建中醫(yī)藥大學骨傷學院，福建福州 350108

骨肉瘤是常見的骨源性惡性腫瘤，化療是其重要的治療手段，但腫瘤耐藥性的存在，成為骨肉瘤復發(fā)和治療失敗的重要原因。明確其耐藥機制，有效預防或逆轉骨肉瘤耐藥是目前臨床亟待解決的問題。本文將對骨肉瘤耐藥機制及其逆轉策略的研究進展作一綜述。

骨肉瘤；耐藥機制；逆轉

骨肉瘤是青少年最常見的一種骨源性惡性腫瘤，在原發(fā)性骨惡性腫瘤中發(fā)病率最高。單純手術治療其治愈率僅有15%～20%，伴隨著新輔助化療其5年生存率提高到70%左右[1]。然而對化療藥物的多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）嚴重影響了其臨床療效和長期生存率。有數(shù)據(jù)顯示復發(fā)患者生存率不足30%[2-3]。因此，研究骨肉瘤MDR發(fā)生機制，尋找有效地預防或逆轉耐藥的方法已成為目前骨肉瘤研究的熱點和難點，也是臨床亟待解決的問題?，F(xiàn)對近年來國內外對骨肉瘤耐藥機制及逆轉研究現(xiàn)狀予以簡要概述。

1 骨肉瘤化療的耐藥機制

骨肉瘤化療耐藥的產生是多種耐藥機制共同作用的結果，是多因素、多水平、多基因參與的復雜過程，主要與膜轉運蛋白、細胞凋亡、細胞內解毒系統(tǒng)、腫瘤干細胞等有關。

1.1 細胞膜轉運蛋白異常

1976年Juliano等首次提出跨膜轉運蛋白的藥泵作用是導致腫瘤細胞耐藥的重要機制，后來被稱為“經(jīng)典MDR”。ABC轉運蛋白（ATP-binding cassette transportes，ABC transporters）超家族成員，包括P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp、ABCB1）、多藥耐藥相關蛋白（multidrug resistance associated protein，MRP1 ABCC1 and MRP2 ABCC2）、乳腺癌多藥耐藥相關蛋白（breast resistance protein，BCRP ABCG2）等，是目前公認的在骨肉瘤耐藥中起重要作用的藥泵蛋白[4]。這些蛋白與藥物結合，通過三磷酸腺苷（ATP）供能，改變蛋白構象，將細胞內的抗腫瘤藥物排出細胞外，從而降低細胞內藥物有效濃度，導致腫瘤細胞耐藥[5]。黃綱等[6]研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤對化療不敏感與MDR1、P-gp表達有關。Celia等[7]發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細胞對化療藥物的敏感性與MDR1表達水平密切相關，MDR1水平越高，則藥物敏感性越低。而抑制ABCB1的表達可以抑制骨肉瘤耐藥株中P-gp的表達，增加細胞內阿霉素的濃度，從而可以有效地抑制其耐藥性[8]。

1.2 細胞凋亡調控異常

眾多化療藥物通過誘導細胞凋亡達到殺傷腫瘤細胞的作用。但同時也可能誘發(fā)凋亡調節(jié)因子發(fā)生變化而產生耐藥。凋亡相關蛋白異常表達或功能缺陷都將引起細胞對化療藥的耐受。Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白與凋亡前分子的比例決定細胞是否走向凋亡[9]。Bcl-2過表達將抑制大多數(shù)化療藥物所引起的靶細胞凋亡，吳小三等[10]利用RT-PCR及Westernblot技術對耐藥前后的骨肉瘤細胞中的Bcl-2基因含量進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)Bcl-2基因及其表達蛋白在耐藥細胞株MG63/R中表達明顯高于敏感細胞株MG63。Zhao等[11]發(fā)現(xiàn)慢病毒介導的Bcl-2基因沉默后，可以使MG63耐藥株的凋亡增加，同時對阿霉素的敏感性增加。

凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis protein，IAPs）家族是細胞內一類重要的凋亡抑制因子，包括XIAP、Hiap-1、Hiap-2、NAIP、Survivin、Apollon和Livin等，主要通過抑制天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）來抑制細胞凋亡。其中目前研究較多的是Survivin蛋白與Livin蛋白。聶濤等[12]研究骨肉瘤中Survivin蛋白表達及其與P-gp、Bcl-2蛋白表達的相關性中發(fā)現(xiàn)Survivin在骨肉瘤中呈高表達，與P-gp表達有明顯的一致性，與臨床耐藥密切相關。傅培榮等[13]通過檢測骨肉瘤標本（觀察組）及骨軟骨瘤標本（對照組）中Survivin蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)觀察組Survivin蛋白的表達率明顯高于對照組，且與病理分級、肺轉移密切相關。而王井偉等[14]觀察Survivin-siRNA轉染MG63細胞后骨肉瘤MG63細胞對阿霉素、順鉑藥物敏感性，發(fā)現(xiàn)Survivin-siRNA抑制Survivin的表達后，增強了骨肉瘤細胞對阿霉素、順鉑的敏感性。安貴峰等[15]采用基因重組技術研究發(fā)現(xiàn)與U2OS細胞、U2OS/neo細胞相比，U2OS/Livin細胞對阿霉素、環(huán)磷酰胺、順鉑等化療藥物的耐藥性明顯增強，表明Livin基因高表達是人骨肉瘤多藥耐藥的原因之一。

1.3 細胞內解毒系統(tǒng)

谷胱甘肽（glutathione，GSH）系統(tǒng)是細胞內解毒系統(tǒng)的關鍵組成部分。GSH在谷胱甘肽S轉移酶（glutathione S-transferaseπ，GST-π）的催化下與某些抗腫瘤藥物形成復合物，成為MRP1的底物，被轉運出細胞外，從而使細胞內的藥物濃度降低，起不到殺傷細胞的作用；同時GSH可與抗腫瘤藥物直接結合降低藥物活性，清除蒽環(huán)類藥物等產生的自由基，減輕其對細胞的損傷。據(jù)報道[16]，GST-π過表達的Saos-2細胞對氯胺順鉑及阿霉素耐藥，而沉默該基因后，對上述兩種藥物的敏感性提高。Michela等[17]也發(fā)現(xiàn)對阿霉素和氨甲蝶呤交叉耐藥的CDDP耐藥株骨肉瘤細胞高表達GST-π。對骨肉瘤組織中GST-π、MRP1等表達檢測發(fā)現(xiàn)，GST-π、MRP1與骨肉瘤的惡性程度呈正相關，為骨肉瘤耐藥的重要原因之一[18]。

1.4 腫瘤干細胞

海倫·凱勒已悄悄起床，她摸到書桌前，打開昨天還未讀完的盲文書，仔細摸著，摸著。天氣尤寒，海倫的手不禁在微微打顫。時間總是過得飛快，天完全亮了，海倫迎來了一天中第一縷陽光，海倫笑了，笑得那樣燦爛，像陽光一樣。知識的滿足和陽光的溫暖，給海倫帶來了慰藉。

腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）是近年來研究的一個熱點。它具有干細胞的特點，即自我更新、無限增殖及分化潛能，在啟動腫瘤形成和生長中起著決定性的作用[19]。CSCs大多處于靜止期或休眠期，使得其對作用細胞周期的化療藥物不敏感。它還能增強DNA修復能力，上調ABC轉運蛋白的表達，高表達抗凋亡基因，對化療藥物具有耐藥性，在骨肉瘤化療治療過程中該類細胞逃避了化療藥物的毒性作用，一旦化療藥物作用消失，該類細胞可以通過自我更新、無限增殖使腫瘤復發(fā)轉移[20]。Tang等[21]發(fā)現(xiàn)化療能夠使骨肉瘤中CSCs比例增加，且CSCs成瘤性增強。Mimeault等[22]認為，干細胞靶點表達缺失的現(xiàn)象可能是其能夠逃脫某些藥物作用的主要原因，干細胞由于長時間接觸輻射或致癌物質而逐漸產生變異，而腫瘤干細胞也存在相同的機制，從而把耐藥性傳給子代腫瘤細胞引起耐藥。Sara等[23]利用懸浮法培養(yǎng)人骨肉瘤細胞株MNNG/HOS，并通過流式分選、引導分化、Wester Blot、化療藥物敏感性等研究，證實通過懸浮培養(yǎng)法可以分選出CSCs細胞，且此類細胞除具有CSCs細胞的一般特性外，還對化療藥物具有抗藥性。Virginia等[24]采用FASC，證實存在于骨肉瘤細胞中CD133+細胞具有較高的增殖能力，能夠在無血清的培養(yǎng)基中形成克隆，同時高表達ABCG2。說明CD133+細胞具有CSCs細胞的特性。因此，CSCs成為腫瘤耐藥的一個重要原因。

2 骨肉瘤耐藥逆轉策略

骨肉瘤耐藥性是多因素、多水平、多基因參與的復雜過程，且相互交叉，相互影響。目前針對骨肉瘤耐藥逆轉的研究還處于探索階段。

2.1 化學藥物逆轉劑

研究較早，研究最為廣泛的一種逆轉MDR的策略。此類藥物的作用機制主要是：①競爭性P-gp抑制劑，它主要作為P-gp底物與細胞毒性藥物競爭性地結合于外排泵上，從而減少化療藥物的外排，達到治療的有效濃度[25]。②非競爭性抑制劑，通過與底物蛋白不同區(qū)域結合，改變底物蛋白的構型，使其活性位點不能被活性底物識別，阻止ATP水解，減少化療藥物從細胞內泵出。但此類藥物或是與ABC轉運蛋白親和力低，需要增加劑量，才能達到療效，與此同時其毒性增加，限制了臨床使用，或可能干擾化療藥物的清除或代謝，顯著提高化療藥物的血藥濃度，從而導致副作用增加[26]。

2.2 基因治療逆轉

腫瘤細胞MDR的產生與某些基因表達不協(xié)調，導致某些與MDR相關的蛋白質和酶異常相關，因此在基因水平尋找逆轉MDR的方法，將有助于MDR問題的解決。隨著反義核酸技術、核酶技術、RNA干涉技術、反義RNA技術等的方法不斷完善，基因治療已經(jīng)廣泛應用于腫瘤耐藥性逆轉研究。

核酶技術（Ribozyme）：核酶正常存在于細胞內并調控基因表達小分子RNA，具有RNA限制性內切酶活性，能特異性與靶RNA特定位點結合，序列切割靶酶RNA，抑制基因表達。在逆轉腫瘤MDR過程中，核酶可針對MDR1mRNA的特定位點進行切割，使P-gp無法表達，達到逆轉MDR的目的。

RNA干擾技術（RNA interference，RNAi）是指由短雙鏈RNA誘導的同源RAN降解，從而導致靶基因的表達沉默，產生相應的功能表現(xiàn)型缺失的現(xiàn)象。小分子干擾RNA（small interference RNA，siRNA）是長度為21～23個核苷酸的雙鏈RNA，可特異性識別同源的mRNA，并切割其中與siRNA反義鏈互補的區(qū)域，從而抑制靶基因的表達。RNAi具有抑制效果確切，且針對性強、不良反應少的特點，使得其應用于逆轉MDR[27]。車彪等[28]將成功構建的針對stathminmRNA的siRNA真核質粒經(jīng)脂質體轉染LM8骨肉瘤細胞，觀察多烯紫杉醇、順鉑作用后細胞的化療敏感性，結果顯示stathmin基因沉默能明顯增加多西紫杉醇對骨肉瘤LM8細胞的化療敏感性并協(xié)同誘導細胞凋亡。

2.3 納米給藥系統(tǒng)逆轉MDR

納米給藥體系是指直徑在10～1 000 nm之間的給藥體系，具有提高藥物穩(wěn)定性、藥物緩釋和控釋的作用。在腫瘤治療過程中，納米給藥系統(tǒng)通過形成載藥納米復合物，可以拮抗和抵消腫瘤細胞主動外排藥物的作用，從而提高腫瘤細胞內藥物濃度。Michiro等[8]以葡聚糖為基礎的聚合物納米粒子作為MDR1 siRNA的載體，作用于骨肉瘤耐藥株，可以通過限制ABCB1（MDR1）表達，達到逆轉其耐藥性的目的。

2.4 中醫(yī)藥逆轉MDR

中藥如人參、川芎、大黃等具有鈣通道阻滯作用，通過大量實驗研究發(fā)現(xiàn)中藥具有逆轉MDR的作用。人參皂苷單體Rb1是三七總皂苷的主要成分，可以逆轉白血病多藥耐藥細胞系（K-562/HHT）的多藥耐藥性，并血液學毒性較低[29]。雙芐基異喹啉類生物堿[30]是具有鈣通道阻滯作用的中藥單體，在體外實驗中有MDR逆轉活性，其作用機制與異博定相似，均有膜調節(jié)作用。王進等[31]研究顯示粉防己堿能逆轉骨肉瘤細胞系的多藥耐藥性，其效果明顯優(yōu)于維拉帕米和環(huán)孢霉素A，逆轉的機制在于抑制耐藥系細胞膜上P糖蛋白的功能，而對其表達水平無影響。肖揚等[32]用姜黃素作用于U2OS/ADM，MTT顯示姜黃素能增加不同濃度阿霉素對U2OS/ADM的抑制作用，F(xiàn)CM結果顯示，姜黃素能增加阿霉素對U2OS/ADM的細胞毒性作用，且呈劑量依賴關系，可有效逆轉U2OS/ADM細胞的多藥耐藥現(xiàn)象。對單味中藥的逆轉MDR作用的研究，現(xiàn)局限于單味中藥的某種成分上，忽視了中醫(yī)理論指導下中藥復方對MDR逆轉的功效。中醫(yī)中藥是一個完整的整體，在臨床應用很少是單味藥物應用的，更多的是在中醫(yī)整體理論指導下的組方用藥。

中藥復方在骨肉瘤的防治基礎研究中現(xiàn)在相對較少，但有著廣闊的發(fā)展前景，因為其能夠體現(xiàn)出中醫(yī)的整體觀念、辨證論治的特色。石宇雄等[33]發(fā)現(xiàn)參麥注射液能逆轉人成骨肉瘤多藥耐藥細胞株R-OS-732，提高細胞內化療藥物的濃度，增加化療藥物的毒性作用。應用骨癌通泰方含藥血清干預人成骨肉瘤耐藥細胞R-KHOS，用RT-PCR檢測MRP基因的表達，發(fā)現(xiàn)骨癌通泰方能夠下調MRP基因的表達，提高骨肉瘤化療曾敏效果[34]。

3 展望

目前對骨肉瘤MDR產生的機制研究已經(jīng)取得了較大進展，但仍存在一定爭議，尚未完全明確其確切的機制。已經(jīng)開發(fā)的耐藥逆轉藥物因存在較多的不良反應，限制了其在臨床的應用。骨肉瘤MDR的發(fā)生是一個多因素參與的復雜過程，利用中藥復方的多種藥物協(xié)同作用，調動機體內在的抗腫瘤能力，增強骨肉瘤對化療藥物的敏感性，開發(fā)出可以逆轉骨肉瘤MDR的有效方劑，將有助于提高骨肉瘤的臨床療效。

[1]Schwartz CL，Gorlick R，Teot L，et al.Children's Oncology Group.Multiple drug resistance in osteogenic sarcoma：INT0133 from the Children's Oncology Group[J].JClin Oncol，2007，25（15）：2057-2062.

[2]Chou AJ，Gorlick R.Chemotherapy resistance inosteosarcoma：currentchallengesand futuredirections[J].ExpertRev Anticancer Ther，2006，6：1075-1085.

[3]Dean M，F(xiàn)ojo T，Bate S.Tumour stem celland drug resistance[J].Nat Rev Cancer，2005，5：275-284.

[4]LourdaM，Trougakos IP，GonosES.Developmentofresistance tochemotherapeutic drugs in human osteosarcoma cell lines largely depends on upregulation of clusterin/Apolipoprotein J[J].Int JCancer，2007，120（3）：611-622.

[5]Takara K，Sakaeda T，Okumura K.An update on overcoming MDR-1mediated multidrug resistance in cancer chemotherapy[J].Curr Pharm Des，2006，12（3）：273-286.

[6]黃綱，李佛保，韓士英，等.骨肉瘤組織中多藥耐藥基因mdr-1 mRNA和P-糖蛋白的表達及其與臨床病理特點關系的研究[J].中華骨科雜志，2000，20（1）：21-25.

[7]CeliaM，F(xiàn)reitasG，Heidi VP，etal.Mutidrug resistancemediated by ABC transporters in osteosarcoma cell lines：mRNA ananlysis and functional radiotracer studies[J].NuclearMedicine and Biology，2006，33：831-840.

[8]Michiro S，Arun KL，Keinosuke R，et al.Inhibition of ABCB1（MDR1）expression by an siRNA nanoparticulate delivery system to overcome drug resistance in osteosarcoma[J].P Los One，2010，5（5）：10764.

[9]Adams JM，Cory S.The Bcl-2 apoptotic switch in cancer evelopment and therapy[J].Oncogene，2007，26（9）：1324-1337.

[10]吳小三，張春林，趙曜，等.應用Cycling D1和Bcl-2為靶標的siRNA慢病毒載體構建和鑒定[J].中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（20）：3709-3713.

[11]Zhao Yao，Zhang Chunlin，Zeng Bingfang，et al.Enhanced chemosensitivity of drug-resistant osteosarcoma cells by lentivirus-mediated Bcl-2 silencing[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2009，390（3）：642-647.

[12]聶濤，戴閩，宗世璋.骨肉瘤中Survivin蛋白表達及其與P-糖蛋白、bcl-2蛋白表達的相關性[J].臨床骨科雜志，2005，8（3）：211-214.

[13]傅培榮，李書忠，李萍.Suivivin、MMP-2、p-53蛋白在骨肉瘤中表達及臨床意義[J].山東醫(yī)藥，2010，50（19）：49-50.

[14]王井偉，田海梅，劉義，等.Survivin-siRNA對骨肉瘤MG-63細胞藥物敏感性的研究[J].軍醫(yī)進修學院學報，2010，31（1）：72-74.

[15]安貴峰，呂剛，曾艷，等.轉染Livin基因后骨肉瘤細胞系的多藥耐藥性研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2009，17（4）：609-613.

[16]Huang G，Mills L，Worth LL.Express of human glutathionw S-transferase P1 mediates the chemosensitivity of osteosarcoma cells[J].Mol Cancer Ther，2007，6：1610-1619.

[17]Michela Pasello，F(xiàn)rancesca Michelacci，Isabella Scionti，et al.Overcoming glutathione S-transferase P1-related cisplatin resistancen in osteosarcoma[J].Cancer Res，2008，68（16）：6661-6668.

[18]汪毅，周琪.多藥耐藥相關蛋白1、谷胱甘肽S轉移酶和DNA拓撲酶Ⅱ在骨肉瘤中的表達[J].重慶醫(yī)學，2006，35（14）：1273-1275.

[19]Mariusz Z，Ratajiczak，Magda Kucia，et al.Emerging concept of cancer asastem celldisorder[J].CentralEuropean JournalofBiology，2006，1（1）：73-87.

[20]Gupta PB，Chaffer CL，Weinberg RA，Cancer stem cell：mirage or reality[J].NatMed，2009，15：1010-1012.

[21]Tang Qinglian，Liang Yi，Xie Xianbiao，et al.Enrichment of osteosarcoma stem cell by chemotherapy[J].Chinese Journal of Cancer，2011，30（6）：426-432.

[22]Mimeault M，Batra SK.Functions of tumorigenic andmigrating cancer progenitor cells in cancer progressionand metastasis and their therapeutic implications[J].Cancer Metastasis Rev，2007，26（1）：203-214.

[23]Sara R Martins-Neves，Aurio O Lopes，Analia Do Carmo，et al.Theraputic implications of an enriched cancer stem-like cell population in a human osteosarcoma cell line[J].BMCCancer，2012，12：139.

[24]Virginia Tirino，Vincenzo Desiderio，Riccardo d'Aquino，et al.Detection and characterization of CD133+cancer stem cells in human solid tumours[J].Plos ONE，2008，3（10）：3469.

[25]O'Connor R.The pharmacology of cancer resistance[J].Anticancer Res，2007，27（3A）：1267-1272.

[26]Minderman H，O'Loughlin KL，Pendyala L，et al.VX-710（biricodar）increase drug retention and enhances chemosensitivity in resistant cells overexpressing P-glycoprotein，multidrug resistance protein，and breast cancer resistance protein[J].Clin Cancer Res，2004，10：1826-1834.

[27]Duan Z，Brakora KA，Seiden MV.Inhibition of ABCB1（MDR1）and ABCB4（MDR3）expressing by small interference RNA and reversal of pacilitaxel resistance in human ovarian cancer cells[J].Mol Cancer Ther，2004，3：833-838.

[28]車彪，邵增務，王凱，等.stathmin基因沉默協(xié)同增效多系紫杉醇對骨肉瘤細胞化療作用的實驗研究[J].中國臨床研究，2010，23（3）：181-183.

[29]史曦凱，張翼軍，趙春景.人參皂甙單體Rb1對多藥耐藥細胞K562/ HHT的耐藥逆轉作用[J].第三軍醫(yī)大學學報，1999，21（11）：825-827.

[30]田暉，譚啟超.雙芐基異喹啉類生物堿與小蘗胺逆轉多藥抗藥性的比較研究[J].藥學學報，1997，32（4）：245-250.

[31]王進，沈靖南.粉防己堿逆轉骨肉瘤細胞系多藥耐藥性的研究[J].實用臨床醫(yī)學，2005，6（7）：7-10.

[32]肖揚，王萬春.姜黃素對人骨肉瘤細胞株/阿霉素多藥耐藥逆轉作用的實驗研究[J].衛(wèi)生研究，2011，40（1）：103-106.

[33]石宇雄，黃永明，許少健，等.參麥注射液對人成骨肉瘤多藥耐藥細胞株R-OS-732逆轉作用[J].廣東醫(yī)學，2006，27（8）：1200-1201.

[34]石宇雄，黃永明，張嫻，等.骨癌通泰方對人成骨肉瘤細胞R-KHOS MRP基因表達的影響[J].陜西中醫(yī)，2009，29（11）：1552-1553.

Research progressof drug resistancemechanism on osteosarcoma chemotherapy and reverse treatment

ZHANG Yan ZHANG Li NIU Susheng LIU Junning
College of Orthopedics,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fujian Province,Fuzhou 350108,China

Osteosarcoma is a sortofmalignant commonly-seen osteogenic sarcomas,a better treatment for it is chemotherapy.However,tumor drug resistance is a key factor causing recurrence of osteosarcoma and treatment failure.Therefore, clearly understand its drug resistancemechanism and further effectively prevent or reverse osteosarcoma's drug resistance are urgent problems needed to be solved in current clinic.The article is going to review on drug resistancemechanism of osteosarcoma and strategy for its reversal.

Osteosarcoma;Drug resistancemechanism;Reverse

R735.340.2

A

1673-7210（2012）11（b）-0023-03

國家自然科學基金（青年項目）（項目名稱：片仔癀對骨肉瘤多藥耐藥性影響的實驗研究；批準號：30901916）。

2012-04-19 本文編輯：張瑜杰）