遲欣 周光紀(jì)

體外再生胰島移植治療糖尿病的研究近況

遲欣 周光紀(jì)

糖尿病是因胰島素抵抗和(或)胰島功能損害所致的以高血糖為特征的內(nèi)分泌代謝性疾病。傳統(tǒng)治療方法以藥物治療為主。藥物治療能控制癥狀，但不能徹底治愈糖尿病。胰島移植是目前治療糖尿病的有效方法，但胰島供體的嚴(yán)重缺乏使其推廣應(yīng)用受到了很大限制。由于干細(xì)胞具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能，理論上可為胰島移植提供豐富的胰島細(xì)胞來源。近年來，對于胚胎干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞以及誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞等誘導(dǎo)分化為胰島樣干細(xì)胞的研究為糖尿病治愈帶來了新希望。

一、胰島移植現(xiàn)狀

過去的臨床實踐發(fā)現(xiàn)，胰腺移植是治療糖尿病的有效方法[1]。然而由于胰腺移植需要同時處理胰腺的內(nèi)分泌和外分泌問題，手術(shù)方式復(fù)雜，并發(fā)癥多。更重要的是，胰腺移植組織配型困難，移植排斥嚴(yán)重。與傳統(tǒng)的胰腺移植或胰腺-腎臟聯(lián)合移植相比，胰島移植時沒有招致排斥反應(yīng)的重要結(jié)構(gòu)——血管，也沒有復(fù)雜的外分泌問題需要處理，而是可以采用注射等簡單方法移植于肝臟、皮下、腎包膜等合適部位，術(shù)式簡單，手術(shù)創(chuàng)傷小，移植排斥弱，并發(fā)癥少，因而更易于在臨床開展[2]。在早期的胰島移植臨床研究中發(fā)現(xiàn)，1型糖尿病患者胰島移植后短期不依靠外源性胰島素者達到了百分之十[3]。后來，加拿大埃德蒙頓市阿拉伯塔大學(xué)的一個研究小組通過認(rèn)真的病例選擇和胰島分離、純化過程的優(yōu)化，首次采用了不使用具有胰島毒性的類固醇激素的抗移植排斥的方法，使胰島移植患者術(shù)后不依賴胰島素的時間長達一年之久。這在胰島移植領(lǐng)域具有“里程碑”式意義，被譽為“埃德蒙頓方案”(Edmenton protocol)[4]。2008年美國聯(lián)合胰島移植注冊網(wǎng)站上發(fā)布的數(shù)據(jù)稱，1999至2007年間279位接受胰島移植的患者中有23%不依賴胰島素生存3年以上，5年的隨訪報告稱65位注冊的患者中有10%不依賴胰島素生存5年以上[5]。像其他器官移植一樣，胰島移植也存在嚴(yán)重的器官供體短缺，而且更為嚴(yán)重。即使是贏得一致贊譽的埃德蒙頓方案，也需要2～3個成年胰腺供體才能滿足一個成年患者的移植需要，這不僅使器官供體短缺問題更加突出，還使本來已不易解決的移植排斥問題更加復(fù)雜。因此，找到新的胰腺β細(xì)胞的來源成為人們研究的熱點。

二、干細(xì)胞再生胰島移植治療糖尿病

由于干細(xì)胞具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能，理論上可以將其定向誘導(dǎo)分化，形成“人工胰島”，為胰島移植提供豐富的胰島細(xì)胞來源。其中以胚胎干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的研究最引人關(guān)注。

1．胚胎干細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)產(chǎn)生的“人工胰島”移植治療糖尿?。号咛ジ杉?xì)胞是來源于胚胎囊胚期“內(nèi)細(xì)胞團”的一種未分化全能型細(xì)胞，具有強大的自我更新能力并能分化為機體所有類型的組織細(xì)胞。它強大的自我更新能力和全能分化特性使其成為胰島β細(xì)胞替代治療(β-cell replace therapy)的種子細(xì)胞來源。Sofia等[6]將人Ins基因通過載體轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞后誘導(dǎo)分化成能分泌胰島素的β-樣細(xì)胞。體外檢測這些細(xì)胞分泌胰島素的量可隨糖濃度的增加而增加。將這些來源于胚胎干細(xì)胞的β樣細(xì)胞植入1型糖尿病小鼠體內(nèi)后，其血糖正?？蛇_1年以上。但Lumelsky等[7]用5步法將小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成的類似胰島結(jié)構(gòu)細(xì)胞的胰島素分泌量僅相當(dāng)于正常細(xì)胞分泌量的1/50，這些細(xì)胞移植到糖尿病小鼠并不能糾正高血糖。周光紀(jì)等[8]改良了Lumelsky的誘導(dǎo)方法，經(jīng)過5階段約28～32 d的連續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)，將小鼠的ESC細(xì)胞誘導(dǎo)成具有胰島素分泌功能的胰島樣β細(xì)胞，在培養(yǎng)液中加入磷酸肌醇激酶抑制劑，將胰島樣細(xì)胞分泌的胰島素含量提高到正常細(xì)胞分泌量的1/10并能輕度改善高血糖狀態(tài)。我們實驗室經(jīng)過優(yōu)化，使ESC分化為胰島素分泌細(xì)胞的時間從文獻報道的18～32 d縮短為18 d左右。將這些胰島素分泌細(xì)胞移植肝內(nèi)6 d后血糖明顯下降，但未恢復(fù)到正常水平；而移植腹股溝區(qū)皮下6 d血糖降至正常[9]。劉星霞等[10]將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的胰島樣細(xì)胞團兩次皮下移植于DM小鼠，第5天血糖水平顯著降低，但仍未能降至正常水平。Lester等[11]利用熒光標(biāo)記的方法證實，恒河猴胚胎干細(xì)胞可以分化成能夠分泌胰島素的細(xì)胞，為臨床模型奠定了基礎(chǔ)。Duvillie等[12]證實人胚胎干細(xì)胞體外在葡萄糖刺激下可以分化為胰腺β樣細(xì)胞，可以在培養(yǎng)基中分泌胰島素。Kroon等[13]利用人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)得到胰腺內(nèi)胚層，移植入小鼠體內(nèi)后能夠根據(jù)血糖的波動相應(yīng)地產(chǎn)生適量的胰島素，移植入小鼠體內(nèi)產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞表現(xiàn)出許多像β細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子等功能性β細(xì)胞的特征性標(biāo)記物。

雖然誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向胰島定向分化的潛能得到證實，但由于對胚胎干細(xì)胞向胰島β細(xì)胞分化的關(guān)鍵過程缺乏了解，所以至今沒有一種真正權(quán)威的誘導(dǎo)方法。轉(zhuǎn)化效率低、胰島素分泌功能差是目前存在的主要問題。

D′Amour等[14]通過調(diào)整培養(yǎng)基中生長因子和小分子抑制劑的成分，從hES細(xì)胞系(CyT203)獲得有胰島素分泌功能的細(xì)胞，在誘導(dǎo)分化5個階段中PDX-1、NGN3、INS以及GCG的表達水平和人體胰腺發(fā)育過程中對應(yīng)階段相同。并應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法和免疫熒光技術(shù)證實，由hES分化來的細(xì)胞胰島素分泌水平與人體胰島的水平相當(dāng)。Assady等[15]將用改良的四步法誘導(dǎo)hES得到的胰腺細(xì)胞移植到裸鼠皮下，移植兩個月后血清中C肽含量快速升高，3個月時血清C肽蛋白含量與小鼠移植3000～5000個人胰島的分泌量相當(dāng)。經(jīng)免疫組化證實，由hES分化來的細(xì)胞具有完整的β細(xì)胞特性。將這些細(xì)胞移植到用STZ破壞了胰島的小鼠，并沒有因為內(nèi)源性胰島的破壞而影響對血糖的調(diào)節(jié)，說明hES分化來的內(nèi)分泌細(xì)胞在調(diào)節(jié)血糖的過程中起到了關(guān)鍵作用。

2．胰腺干細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成“再生胰島”治療糖尿病：胰腺干細(xì)胞主要存在于胰島中，也有少量存在于胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中。從胰腺干細(xì)胞產(chǎn)生“再生胰島”一般有體外擴增誘導(dǎo)和體內(nèi)誘導(dǎo)兩種方法[16]。Vaca等[17]從人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中分離到胰腺干細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)后得到有胰島樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團，但其擴增的周期長,所得細(xì)胞數(shù)量少。我們課題組王燕虹用正交設(shè)計優(yōu)化了培養(yǎng)基成分和人胚胎胰腺干細(xì)胞的分離純化方法，從妊娠4～6個月流產(chǎn)的胎兒胰腺組織中分離胰島，然后將胰島貼壁培養(yǎng)，擴增胰島中的胰腺干細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擴增15代后,細(xì)胞總數(shù)可達原來的1010倍；具有胰腺干細(xì)胞標(biāo)志的ABCG2陽性細(xì)胞和nestin陽性細(xì)胞可達原來的1012倍，且ABCG2陽性細(xì)胞的擴增能力要優(yōu)于nestin陽性細(xì)胞。這些經(jīng)連續(xù)擴增的細(xì)胞經(jīng)過體外定向誘導(dǎo)可形成具有胰島素分泌功能的細(xì)胞，自發(fā)聚集成具有胰島樣結(jié)構(gòu)的胰島樣細(xì)胞團(islet-like cell clusters,ICCs),并對葡萄糖刺激敏感[18]。Ramiya等[19]從未發(fā)病的成年非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的胰導(dǎo)管上皮中分離出胰腺干細(xì)胞，經(jīng)體外擴增并誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞團，移植后兩周內(nèi)血糖有所下降，但血糖濃度仍高于正常水平。Huang[20]、Wu等[21]的研究也將人胎兒胰腺組織來源的胰腺干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞，移植入糖尿病小鼠體內(nèi)可糾正其高血糖。趙婷等[22]發(fā)現(xiàn)，移植胰腺干細(xì)胞后的大鼠在移植后第6周血糖開始降低并且能夠長時間使血糖維持在較低的水平，但對葡萄糖的刺激沒有快速相的胰島素分泌。張悅、楚元奎等[23-24]分別從胎鼠及胎豬中分離得到胰腺干細(xì)胞，經(jīng)體外擴增后移植入相應(yīng)糖尿病模型，發(fā)現(xiàn)胰島樣干細(xì)胞在體內(nèi)微環(huán)境的調(diào)節(jié)下增殖為胰島樣結(jié)構(gòu)，并且受體的血糖水平得到了較好控制。

3．間充質(zhì)干細(xì)胞再生胰島移植治療糖尿?。何墨I報道，骨髓、臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，通過對pdx-1基因的誘導(dǎo)，也會具有胰島β樣細(xì)胞的特征，并且具有取材方便，體外誘導(dǎo)、分離、培養(yǎng)和純化簡單的特點[25]。余衛(wèi)等[26]從胎鼠肝臟中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島樣β細(xì)胞，移植到1型糖尿病小鼠的腎被膜下，6周后小鼠的血糖得到良好的控制。臍帶、骨髓來源的干細(xì)胞也成功被誘導(dǎo)分化為胰島β樣細(xì)胞，在大鼠的糖尿病模型中得到應(yīng)用并取得良好效果。龐榮清等[27]將骨髓來源的β樣細(xì)胞移植于彌猴，證實可以使血糖、胰島素和c肽的分泌回復(fù)正常。

4．誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,iPS)在糖尿病治療中的前景：隨著新技術(shù)的應(yīng)用，人的成體細(xì)胞能夠被重新誘導(dǎo)成象胚胎干細(xì)胞一樣的多能干細(xì)胞——誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞[28]。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的成功獲得使得胰島β細(xì)胞的來源有了新的前景。2009年，Maehr等[29]用1型糖尿病患者的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)出iPS細(xì)胞分化出了具有胰島素分泌功能的細(xì)胞，為糖尿病的治療開辟了新的途徑。iPS的出現(xiàn)使可以自體移植、完全不出現(xiàn)移植排斥的“自體胚胎干細(xì)胞”成為現(xiàn)實，是近年來最令人鼓舞的進展。

三、問題與展望

干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)成胰島素分泌細(xì)胞移植，為糖尿病的治療帶來了新的希望，但仍有諸多問題需要解決。(1)轉(zhuǎn)化效率問題：目前從干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率較低，大量干細(xì)胞誘導(dǎo)后僅能得到數(shù)量有限的胰島素分泌細(xì)胞，且其功能較差，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床實際運用的要求。(2)分化細(xì)胞的“年齡結(jié)構(gòu)”問題：干細(xì)胞在體外擴增后同步誘導(dǎo)分化，所有細(xì)胞均同步分化為成熟細(xì)胞。這些細(xì)胞移植后，同步地生長、衰老，最后也同步消亡，使療效完全喪失。這顯然不符合治療的要求。如何能使移植細(xì)胞具有“年齡結(jié)構(gòu)”，做到“可持續(xù)發(fā)展”，長期保持療效，是今后要解決的重要問題。(3)移植排斥問題：異體來源的干細(xì)胞形成的胰島素分泌細(xì)胞是否具有免疫原性，過去未受到足夠重視。我們最近剛完成的實驗發(fā)現(xiàn)(資料待發(fā)表)，在胚胎干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化過程中，引起移植排斥的主要組織相容性抗原(MHC)表達進行性增加，激活淋巴細(xì)胞的能力也相應(yīng)地增強，移植后出現(xiàn)強烈的移植排斥反應(yīng)。這說明和傳統(tǒng)的組織器官移植一樣，胚胎干細(xì)胞衍生的組織、器官移植也一樣面臨排斥問題。間充質(zhì)干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞有可能實現(xiàn)“自體移植”，避免移植排斥，但其他問題依然存在。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.027

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2011-10-13)

(本文編輯：呂芳萍)