湯曉東 劉雙海

·綜述與講座·

胰腺癌基因治療進(jìn)展

湯曉東 劉雙海

胰腺癌多發(fā)生于中老年人，發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率高于發(fā)展中國(guó)家。隨著我國(guó)生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，近年來(lái)胰腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，并且有年輕化的傾向。目前對(duì)于胰腺癌的治療方法主要包括手術(shù)切除、放化療、基因治療、內(nèi)分泌治療、中醫(yī)治療等，但仍沒(méi)有徹底治愈的方案，各國(guó)學(xué)者仍在致力于研究更有效的治療方法。近年來(lái)，分子靶向治療成為腫瘤治療領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，本文就胰腺癌的基因治療方面取得的最新研究成果做一綜述。

一、反義基因治療

反義基因治療技術(shù)的原理是反義寡核苷酸以互補(bǔ)的形式與特定的DNA或RNA序列結(jié)合，從而阻止DNA的轉(zhuǎn)錄或RNA的翻譯，使腫瘤基因無(wú)法表達(dá)。在胰腺癌中，最常見(jiàn)K-ras基因突變，因此，K-ras基因常作為胰腺癌基因治療的靶點(diǎn)。此外，通過(guò)反義核酸技術(shù)使突變基因ATK2、cerbB2激活抑癌基因表達(dá)，從而達(dá)到治療目的。Morioka等[1]應(yīng)用靶向K-ras的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞HaP-T1可抑制其增殖，且能使基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白-9(MMP-9) 的活化下調(diào)；在動(dòng)物體內(nèi)種植瘤實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用反義寡核苷酸治療的動(dòng)物生存期顯著長(zhǎng)于對(duì)照組，且發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的時(shí)間更晚。我國(guó)學(xué)者韓旭等[2]應(yīng)用電轉(zhuǎn)染方法分別用整合素αV、β3及αVβ3反義基因治療胰腺癌大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、αV組、β3組及αVβ3組腫瘤質(zhì)量分別為 (1.17±0.79)、(0.95±0.26)、(1.013±0.42)和(0.79±0.56)g；微血管密度分別為18.33±1.39、13.80±1.06、15.96±1.24和12.16±1.23；腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為12.30±1.393、22.17±1.23、20.37±1.07和24.10±0.99，各組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。作者認(rèn)為，應(yīng)用整合素αV、β3和αVβ3反義基因治療可通過(guò)抑制癌組織血管生長(zhǎng)，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

二、自殺基因治療

自殺基因治療也稱作前體藥物敏感基因療法(prodrugsensitive genes therapy)，是利用轉(zhuǎn)基因的方法將哺乳動(dòng)物本身不含有的藥物酶基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)。該基因表達(dá)的產(chǎn)物可以將無(wú)毒的藥物前體轉(zhuǎn)化為有毒性的藥物，從而干擾腫瘤細(xì)胞DNA的合成，殺死腫瘤細(xì)胞[3]。Eisold等、Fogar等[4-5]研究報(bào)道，胞嘧啶脫氨酶(cystodine deaminase，CD)能夠催化5-氟胞嘧啶(5-FC)轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)，因5-FU具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒作用，能夠抑制DNA和RNA的合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此CD基因是一種自殺基因。Li等[6]將攜帶CD基因的腺病毒pAd Track-CMV-CD感染細(xì)菌，與pAdEasy-1整合，后再感染人胰腺癌細(xì)胞系Patu8988和SW1990，然后在這兩種細(xì)胞系的培養(yǎng)液中中加入5-Fc，所獲得的陽(yáng)性克隆中病毒脂質(zhì)內(nèi)的CD基因濃度高達(dá)2×1011pfu/ml。張世能等[7]用同源重組技術(shù)構(gòu)建了腺病毒Ad-CD、Ad-GFP和Ad-CD/UPRT，體外感染人胰腺癌細(xì)胞SW1990，同時(shí)，建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，在瘤體內(nèi)注射腺病毒進(jìn)行治療。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染CD/UPRT的胰腺癌SW1990細(xì)胞對(duì)5-FC的敏感性明顯提高,Ad-CD/UPRT組的半數(shù)抑制劑量(IC50)為25 μmol/L,而Ad-CD組和Ad-GFP組分別為100 μmol/L和>1000 μmol/L。Ad-CD組、Ad-CD/UPRT組和Ad-GFP組的細(xì)胞凋亡率分別為61.3%、40.5%和3.0%,3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ad-CD/UPRT瘤內(nèi)注射治療后，移植瘤體積縮小81%,Ad-GFP治療腫瘤致使其縮小63%。作者認(rèn)為CD/UPRT自殺基因系統(tǒng)能夠顯著地加速胰腺癌細(xì)胞的凋亡。Tang等[8]對(duì)胃癌的研究和Kajiwara等[9]對(duì)鼻咽癌的研究證實(shí)，單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(herpessimplex virus thymidine kinase，HSV-tk)基因可催化抗病毒藥物丙氧鳥(niǎo)苷(GCV)產(chǎn)生磷酸化反應(yīng)，通過(guò)阻止DNA復(fù)制過(guò)程發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)。Luo等、Duarte等[10-11]報(bào)道指出，目前HSV-TK基因療法最常用的藥物主要是嘌呤核苷類似物，包括阿昔洛韋(ACV)及其衍生物GCV、潘洛昔非(PCV)和布洛昔非(BCV)，其中GCV最常用。

三、免疫基因治療

免疫基因治療就是將各種細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤或其他免疫效應(yīng)細(xì)胞，使其在機(jī)體表達(dá)分泌細(xì)胞因子或利用其他基因分子增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性或免疫系統(tǒng)功能，或應(yīng)用IL-4基因修飾的胰腺癌疫苗等使機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體進(jìn)行免疫基因治療，以加速腫瘤的消退。Liu等[12]研究表明，gammadelta-T細(xì)胞具有先天的抗腫瘤特性， 能夠識(shí)別并殺死腫瘤細(xì)胞， 特別是對(duì)上皮細(xì)胞起源的惡性腫瘤更為敏感，因此可將其用于治療上皮細(xì)胞起源的胰腺癌。此外，Yang等[13]在小鼠模型中應(yīng)用轉(zhuǎn)染突變K-ras基因且表面有效表達(dá)抗原表位(K-ras-12-Val) 的樹(shù)突狀細(xì)胞(dentritic cell， DC)，結(jié)果表明治療組小鼠有更高的存活率和更長(zhǎng)的存活時(shí)間，且移植瘤的體積更明顯縮小[(68±13)mm3比(87±14)mm3和(79±19)mm3，P<0.05]，成為腫瘤免疫基因治療的新熱點(diǎn)。Xu等[14]構(gòu)建了一種CEA啟動(dòng)子調(diào)控的溶瘤腺病毒載體用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在人胰腺癌PANC1免疫缺陷的裸鼠移植瘤模型中，CEA啟動(dòng)子調(diào)控的腺病毒AdCEAp-HSP70能夠顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)；在大鼠胰腺癌DSL-6A/C1模型中，CD4+、CD8+和gamma/delta T細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)宿主分泌細(xì)胞因子TGF-β、INF-γ和IL-6，產(chǎn)生雙抗腫瘤作用，完全抑制胰腺癌的生長(zhǎng)。作者認(rèn)為，CEA啟動(dòng)子控制下的溶瘤腺病毒對(duì)癌癥的基因治療具有較高的安全性和療效，具有廣闊的應(yīng)用和發(fā)展前景。

四、抗血管形成基因治療

這種療法依賴于激活抑制血管生長(zhǎng)因子(VEGF)或TNF、p53、PEDF等抑制因子，抑制腫瘤的血管形成和生長(zhǎng)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。Zhu等[15]采用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)60例配對(duì)胰腺癌組織的HIF-1α、EPAS1和VEGF mRNAs的表達(dá)；采用蛋白質(zhì)印跡法和免疫組化法、過(guò)氧化物酶法檢測(cè)HIF-1α、EPAS1和VEGF蛋白的表達(dá)，同時(shí)評(píng)估微血管密度(MVD)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織的EPAS1、VEGF基因表達(dá)顯著升高，MVD顯著增加，EPAS1與VEGF、VEGF與MVD、EPAS1與MAD之間均具有顯著的相關(guān)性，EPAS1、VEGF的表達(dá)與MVD及TNM分期、腫瘤大小顯著相關(guān)。Elbarbary等[16]研究認(rèn)為，可溶性重組血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGF-Trap可與VEGF緊密結(jié)合，顯著抑制VEGF的功能，從而使胰腺癌細(xì)胞處于缺血狀態(tài)。Pittella等[17]制備了具有生物相容性的CAP/siRNA混合納米材料，將攜帶VEGF的siRNA納米粒子材料治療裸鼠皮下BxPC3種植瘤，可抑制種植瘤的生長(zhǎng)，并與腫瘤中的siRNA蓄積增強(qiáng)和顯著的VEGF基因沉默具有良好的一致性。

五、腫瘤裂解病毒基因治療

這種療法基于經(jīng)改造過(guò)的野生型病毒能裂解腫瘤細(xì)胞而不會(huì)損害正常細(xì)胞的機(jī)制。Bouvet等[18]應(yīng)用含野生型p53抑癌基因構(gòu)建的Ad5/CMV/β-半乳糖苷酶測(cè)定6個(gè)p53突變體胰腺癌細(xì)胞系(AsPC-1、BxPC3、Capan-1、CFPAC-1、MIA PaCa-2和PANC-1)的轉(zhuǎn)染率，結(jié)果MIA PaCa-2轉(zhuǎn)染率最高，在MOI50時(shí)，其β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率高達(dá)65%，而CFPAC-1細(xì)胞的β-半乳糖苷酶表達(dá)率只有15%。腺病毒介導(dǎo)的p53基因以劑量依賴的方式抑制人胰腺癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)。作者認(rèn)為，通過(guò)腺病毒介導(dǎo)野生型p53將p53突變體引入胰腺癌中可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。Hwang等[19]的小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的p53基因?qū)κ笤l(fā)胰腺癌或轉(zhuǎn)移性胰腺癌的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。最新的一些研究[20-22]表明，腺病毒ONYX-015是E1B(55 kDa)基因缺失的腺病毒，而E1B基因與腫瘤抑制蛋白p53結(jié)合能阻斷p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性已應(yīng)用于臨床，成為胰腺癌治療的一種新策略。美國(guó)Jonaaon綜合癌癥研究中心2003年報(bào)道的I期、II期臨床試驗(yàn)[23]結(jié)果顯示，腺病毒ONYX-015經(jīng)內(nèi)鏡超聲引導(dǎo)注射入21例胰腺癌患者的癌組織內(nèi)，每2周1次，共4次，治療后有10例患者的腫瘤體積有縮小或無(wú)進(jìn)展。Caseante等[24]將HIV病毒TAT蛋白上的一個(gè)堿性結(jié)構(gòu)域中的8肽與胸苷激酶組合成Tat8-TK/GCV系統(tǒng)，并將其用于體內(nèi)試驗(yàn)，結(jié)果35.6%～50%的腫瘤體積縮小。宰紅艷等[25]應(yīng)用pGCSIL-PUR和pGCSIL-NEO分別構(gòu)建針對(duì)XIAP和survivin的shRNA慢病毒載體，將其感染胰腺癌細(xì)胞SW1990和PANC1，經(jīng)嘌呤霉素和新霉素篩選并擴(kuò)大培養(yǎng)得到穩(wěn)定感染株。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞的XIAP和survivin的表達(dá)；MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖和化療敏感性；測(cè)定caspase-3/7活性；DAPI 染色分析細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，獲得XIAP和survivin表達(dá)穩(wěn)定的SW1990和PANC1細(xì)胞的增殖均明顯減弱，且兩種基因有協(xié)同抑制作用。雖然它們的細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響，但能明顯增加其對(duì)化療藥物(5-FU、吉西他濱)的敏感性。此結(jié)論為基于慢病毒載體的胰腺癌靶向基因治療提供了新的思路。

六、受體基因治療

生長(zhǎng)抑素受體SST2能夠介導(dǎo)生長(zhǎng)抑素產(chǎn)生抗增殖效應(yīng)，但人胰腺癌組織中無(wú)SST2基因表達(dá)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者[26-28]將SST2基因引入人胰腺癌組織并使其穩(wěn)定表達(dá)，從而喚起機(jī)體的自分泌反饋環(huán)，起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果。郝昆等[29]應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾(RNAi)技術(shù)建立穩(wěn)定低表達(dá)胰島素樣生長(zhǎng)因子1類受體(IGF1R)基因的人胰腺癌PANC1細(xì)胞株，并觀察其對(duì)吉西他濱化療敏感性的影響。結(jié)果顯示，吉西他濱對(duì)低表達(dá)IGF1R基因的PANC1細(xì)胞的IC50從(0.774±0.001)mg/L下降到(0.330±0.003)mg/L，即對(duì)吉西他濱的敏感性增加了2.35倍。在裸鼠移植瘤模型中，干擾IGF1R基因后皮下移植瘤生長(zhǎng)緩慢，聯(lián)合應(yīng)用吉西他濱后對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用進(jìn)一步增加。作者認(rèn)為，慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)特異性沉默IGF1R基因，能顯著增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1對(duì)吉西他濱的敏感性。

七、特異性啟動(dòng)子基因治療

該療法利用基因的靶向性傳送，將某些相關(guān)的特異性啟動(dòng)子導(dǎo)入癌細(xì)胞，從而增加其對(duì)癌細(xì)胞的殺傷效能。劉金龍等[30]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，由Egr-1啟動(dòng)子調(diào)控的TK自殺基因在γ射線作用下可以顯著提高殺傷胰腺癌細(xì)胞的能力。陳儉云等[31]將U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的survivin特異性RNAi質(zhì)粒載體和陰性對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞，用RT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測(cè)survivin mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染survivin特異性RNAi 載體24 h和48 h后，PANC1 細(xì)胞survivin mRNA表達(dá)抑制率分別為(52.67±3.51)% 和(75.33±3.06)%，蛋白表達(dá)抑制率分別為(58.00±3.61)% 和(76.67±4.73)%。Hendruschk等[32]的研究也得到類似的結(jié)果。由此可見(jiàn)，特異性啟動(dòng)子基因治療或?qū)⒊蔀槟[瘤治療領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.025

214400 江蘇江陰，東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬江陰醫(yī)院 肝膽外科

劉雙海，Email:liushuanghai@medmail.com.cn

2012-08-06)

(本文編輯：呂芳萍)