段 煉,杜 耀,陸秋琳,蔡衛(wèi)丹,方治國,劉惠君 (浙江工商大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州 310012)

一種新型的“綠色溶劑”—離子液體因具有極低的蒸汽壓、不揮發(fā)、導(dǎo)電性強(qiáng)、對許多無機(jī)鹽和有機(jī)物有良好溶解性等諸多優(yōu)點(diǎn)使之在分離過程、電化學(xué)和化學(xué)反應(yīng)等領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景[1].然而離子液體的結(jié)構(gòu)與其毒性和生態(tài)效應(yīng)存在相關(guān)性[2],離子液體的化學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定性導(dǎo)致其在環(huán)境降解、殘留和生態(tài)效應(yīng)等方面具有潛在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn),近年來其環(huán)境行為及生態(tài)毒性引起了研究者的關(guān)注[3],在離子液體對大型蚤、斑馬魚、蚯蚓、鹵蟲的急慢性毒性影響及酶活性等方面做了相關(guān)研究[4-7].

由于離子液體較好的水溶性,其對水環(huán)境的影響不容忽視[3].近年來離子液體對綠藻、大型蚤和斑馬魚生物生長抑制率的影響已有研究報(bào)導(dǎo)[8-10].然而目前對于咪唑氯鹽離子液體對藻類影響的研究較少.本文研究 1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽([BMIM]Cl)對斜生柵藻的影響,從 IC50、葉綠素含量、酶活性、細(xì)胞通透性以及藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察等5個方面,獲得供試離子液體對藻類影響的參數(shù),為認(rèn)識和評價離子液體環(huán)境安全性提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)條件

斜生柵藻(S.obliquu)購自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所國家淡水藻種庫(FACHB).將藻種接種至滅過菌的水生 4號(HB-4)人工培養(yǎng)液[11]中,于SPX智能型可編程光照培養(yǎng)箱恒溫光照培養(yǎng).培養(yǎng)條件:用4層紗布封口以防污染,培養(yǎng)溫度為25℃,光照63μmol/(m2·s),光暗比為16h:8h.每天定時搖動3次.

1.2 主要試劑

1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽([BMIM]Cl)購自中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所綠色化學(xué)與催化中心,純度為99%;考馬斯亮藍(lán)和牛血清白蛋白購自上海生工生物工程有限公司;TEM樣品包埋劑為SPI-CHEM Spurr resin,產(chǎn)自美國;其他試劑均為分析純;水為二次亞沸蒸餾水.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

取 100mL濃度為 3.5×105個/mL的藻液, [BMIM]Cl處理濃度為 0,20,40,80,120,180, 250mg/L,調(diào)節(jié) pH8.0,每一處理設(shè)置3組平行.實(shí)驗(yàn)分2批處理,第1批每天定時測定生物量,96h后測葉綠素含量,另1批培養(yǎng)96h后測定過氧化氫酶活性、超氧化物歧化酶活性、細(xì)胞通透性,取對照及中濃度 80mg/L[BMIM]Cl處理的藻液進(jìn)行細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察.

1.4 分析測定方法

1.4.1 生長抑制 采用顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù),并在波長680nm下測定斜生柵藻光密度,建立不同藻細(xì)胞濃度和光密度之間的關(guān)系. [BMIM]Cl對藻的抑制率=100%×(對照組生物量-處理組生物量)/對照組生物量[12].采用 Logistic模型對濃度-抑制率之間的關(guān)系進(jìn)行擬合,計(jì)算相應(yīng)的IC50值[13].

1.4.2 葉綠素含量 取60mL藻液3000g離心10min后加90%丙酮,搖勻,在低溫暗處抽提24h,在3000g離心10min后取上清液,在750nm處調(diào)零以扣除溶液中懸浮液的吸光值,采用Humphrey和Jeffrey公式計(jì)算葉綠素a和葉綠素b的含量[14].

1.4.3 氧化應(yīng)激 取 60mL藻液在 4℃,6000r/ min下離心 10min;棄去上清液,加入 10mL的50mmol/L磷酸緩沖液,用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎藻細(xì)胞(破碎條件:功率800W,破碎3s,間隔10s,破碎20次);在4℃,15000r/min下離心10min,取懸浮液在-80℃冰箱中保存.過氧化氫酶 (CAT)參照 Aebi等[15]的方法測定,超氧化物歧化酶(SOD)用氮藍(lán)四唑法(NBT法)[16]測定.

1.4.4 細(xì)胞通透性影響 參照 Vigneault等[17]的方法研究[BMIM]Cl對藻細(xì)胞通透性的影響.向藻液(藻細(xì)胞密度為 7.0×105個/mL)中移取適量熒光素二乙酸甲酯(FDA)溶液使其濃度為3.0×10-6mol/L.用熒光分光光度計(jì)測定FDA加入后10min內(nèi)的水解速率,在沒有藻液的空白溶液中1h內(nèi)FDA沒有水解.溶液熒光強(qiáng)度隨時間變化的線性方程的斜率為水解速率,以此反應(yīng)藻細(xì)胞的通透性.

1.4.5 透射電鏡觀察 分別取 96h的對照、80mg/L[BMIM]Cl處理的藻液,3000r/min離心后收集的藻體用于細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察.用2.5%的戊二醛固定12h后,用磷酸緩沖液漂洗3次;再用鋨酸固定,酒精梯度脫水后,用丙酮梯度脫水;包埋劑浸透后包埋12h,36℃到60℃聚合后修塊,切片后染色,水洗,干燥,最后在日立Model H-7650透射電鏡下觀察斜生柵藻的超微結(jié)構(gòu)[13].以上工作在浙江大學(xué)生物電鏡室完成.

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用Origin8.0軟件處理.

2 結(jié)果與討論

2.1 [BMIM]Cl對斜生柵藻生物量的影響

在處理后24h時,[BMIM]Cl對斜生柵藻的生長抑制作用不明顯,低濃度處理組對斜生柵藻的生長反而有一定的促進(jìn)作用,20和40mg/L的處理抑制率分別為-3%、-4%,高濃度(250mg/L)對斜生柵藻的生長抑制率也僅為25%.由圖1可以看出,低濃度處理組的斜生柵藻的生長隨著時間的延長抑制率降低,40mg/L處理48,72,96h的抑制率分別為23.8%、15.8%和7.6%,表現(xiàn)出低濃度處理下生長的恢復(fù).而高濃度處理組,抑制率隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸增大,250mg/L處理組48,72,96h的抑制率分別為67%、78%和84%.通過斜生柵藻的生長抑制率計(jì)算得IC50(表1),隨著培養(yǎng)時間的延長IC50值減小, 48h IC50、72h IC50和96h IC50分別為103.77,76.44,68.49mg/L.

圖1 采用Logistic模型擬合的濃度-抑制率之間的關(guān)系曲線Fig.1 Concentration-response fitting curve using the Logistic model

表1 Logistic模型參數(shù)和預(yù)測的IC50值Table 1 Parameters of the Logistic model and the IC50

不同的離子液體對藻類的毒性不同,李俊峰等[18]研究了 6種咪唑類離子液體對斜生柵藻的毒性效應(yīng),發(fā)現(xiàn)烷基取代鏈長度的增加將增大其對斜生柵藻的毒性.本實(shí)驗(yàn)在固定藻的培養(yǎng)條件下,[BMIM]Cl的毒性隨著時間的延長而增強(qiáng),表現(xiàn)為抑制率增加,IC50值減小.

2.2 [BMIM]Cl對斜生柵藻葉綠素含量的影響

葉綠素作為植物進(jìn)行光合作用的主要色素,其含量高低能夠反映出光合作用水平的強(qiáng)弱[19]. [BMIM]Cl處理后96h斜生柵藻的Chla和Chlb含量的變化趨勢與其生物量的變化趨勢一致(表2),低濃度處理組Chla和Chlb的含量低于對照組但沒有達(dá)到顯著水平(P＞0.05),經(jīng) 20和 40mg/L處理的藻細(xì)胞Chla的含量分別是對照的95.2%和 88.0%;隨著[BMIM]Cl濃度的增加,Chla和Chlb含量總體呈下降趨勢,180、250mg/L處理組Chla的含量分別是對照的 31.3%和 26.5%,與對照相比差異達(dá)到顯著水平(P＜0.05).Chlb含量的下降趨勢與 Chla含量下降趨勢一致.[BMIM]Cl濃度的升高導(dǎo)致藻細(xì)胞生長受抑制,Chla和Chlb的濃度下降.這可能是因?yàn)閇BMIM]Cl進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生活性氧,細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累導(dǎo)致葉綠素和葉綠體結(jié)構(gòu)破壞,通過對藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察,發(fā)現(xiàn)[BMIM]Cl對葉綠體片層結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響,從而降低葉綠素合成相關(guān)酶的活性,葉綠素合成受阻致使藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素含量減少,在實(shí)驗(yàn)后期也可以觀察到高濃度處理的藻體溶液變白.

表2 [BMIM]Cl處理96h后斜生柵藻Chla和Chlb含量Table 2 The chlorophyll a and chlorophyll b content of S. obliqnus after 96 h [BMIM]Cl exposure

2.3 [BMIM]Cl對斜生柵藻CAT和SOD活性的影響

由圖2a可知經(jīng)[BMIM]Cl不同濃度處理,斜生柵藻CAT活性整體呈現(xiàn)減小的趨勢.在低濃度處理組(20mg/L),CAT酶活性是對照的99.7%,與對照相比沒有達(dá)到顯著水平.80mg/L處理組CAT酶活性是 0.048U/mg蛋白,經(jīng) 180、250mg/L [BMIM]Cl處理的藻細(xì)胞CAT活性降低到0.024和0.017U/mg蛋白,分別是對照組(0.070U/mg蛋白)的34.3%和24.3%.與對照相比,[BMIM]Cl處理對斜生柵藻細(xì)胞的SOD活性表現(xiàn)為低濃度激活高濃度抑制(圖2b).在20mg/L實(shí)驗(yàn)組,SOD活性是對照組102.8%,與對照相比沒有達(dá)到顯著水平.隨著處理濃度的增加 SOD活性減小,當(dāng)處理濃度達(dá)到180,250mg/L時,SOD活性分別是對照的62.5%和57.0%.

圖2 [BMIM]Cl處理96h后斜生柵藻CAT和SOD活性Fig.2 Catalase and Superoxide Dismutase activity of S. obliqnus after 96h [BMIM] Cl exposure

不同的環(huán)境脅迫下如重金屬、農(nóng)藥等都會影響生物的生長,這些影響因素可能會產(chǎn)生一些活性氧自由基(ROS),ROS如不能夠及時清除,聚集在生物體內(nèi)會破壞生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸和脂類等,對生物產(chǎn)生損害作用[20].ROS能夠誘導(dǎo)抗氧化酶系的活性,超氧自由基在 SOD的催化下與氫離子結(jié)合,生成過氧化氫,過氧化氫在過氧化氫酶作用下生成水和氧氣[21].已有報(bào)道證明污染物對藻細(xì)胞抗氧化酶系的影響[22].本研究中低濃度處理對SOD與CAT活性影響不大并表現(xiàn)出一定程度的增大,表現(xiàn)出對[BMIM]Cl處理的氧化應(yīng)激反應(yīng),這可能是斜生柵藻表現(xiàn)出的應(yīng)對[BMIM]Cl影響的一種保護(hù)機(jī)制;在高濃度處理組,斜生柵藻生長受到抑制,酶活性受到影響而降低.

2.4 [BMIM]Cl對斜生柵藻細(xì)胞通透性的影響

圖3 [BMIM]Cl處理96h后斜生柵藻的細(xì)胞通透性Fig.3 Cell permeability of S. obliqnus after 96h [BMIM] Cl exposure

沒有熒光活性的熒光素二乙酸甲酯(FDA)可被體內(nèi)的脂酶代謝生成具有熒光活性的熒光素[23],FDA難以通過完整的細(xì)胞膜,因此熒光素的熒光強(qiáng)度可用以表征細(xì)胞膜的完整性和通透性[24-25].單位時間內(nèi)測定的熒光強(qiáng)度越大,表明藻類細(xì)胞的代謝活性越高,細(xì)胞膜的通透性越強(qiáng)[26]. [BMIM]Cl對藻細(xì)胞通透性的影響如圖 3所示. [BMIM]Cl增加了斜生柵藻的細(xì)胞通透性. 20mg/L[BMIM]Cl處理的藻細(xì)胞通透性為對照的1.5倍,隨著濃度的升高,這種刺激效應(yīng)更加明顯.高濃度處理顯著增加了細(xì)胞通透性,當(dāng)處理濃度增加為 120,180mg/L時,藻細(xì)胞的通透性分別為對照的5.7和7.4倍.

2.5 斜生柵藻的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

圖 4是對照(圖 4A1和 4A2)和 80mg/L [BMIM] Cl處理(圖4B1、4B2、4B3和4B4)的藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)圖.在對照全景圖(圖 4A1)中有許多完整的單個細(xì)胞,呈橢圓形和紡錘形,排列比較密集.在圖4A2中的藻細(xì)胞有完整的細(xì)胞壁,致密厚實(shí)的細(xì)胞膜.葉綠體環(huán)繞細(xì)胞并占了大半的細(xì)胞容積,葉綠體中可以看到清晰的片層結(jié)構(gòu).線粒體數(shù)量較多且內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整,脊較明顯,基質(zhì)電子密度高.圓形蛋白核完整,核仁和核質(zhì)清晰.

在80mg/L[BMIM]Cl處理的藻中,全景圖(圖4B1)觀察到一些藻細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變,數(shù)量明顯減少.在單個細(xì)胞中可以明顯觀察到質(zhì)壁分離現(xiàn)象(圖4B4),圖4B2、4B3中葉綠體的片層結(jié)構(gòu)斷裂且層次不清晰,還有一些脂質(zhì)球體分布在葉綠體內(nèi)(圖4B3、4B4).可以觀察到有些線粒體大小正常但嵴的數(shù)量增多(圖 4B2),還有一些線粒體變形腫脹,嵴卻減少(圖4B3、4B4),線粒體內(nèi)還可以看到清晰的膜間隙,在液泡中存在一些沉淀物質(zhì)(圖4B2、4B4).

圖4 80mg/L[BMIM]Cl處理96h后斜生柵藻細(xì)胞透射電子顯微鏡觀察Fig.4 Transmission electron micrographs of S. obliquus cells after 96 h in 80 mg/L[BMIM]Cl treatment

研究表明,逆境條件對藻類細(xì)胞有毒害作用,使得藻細(xì)胞變形、破裂,胞壁和原生質(zhì)體結(jié)合疏松,對藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)中葉綠體、線粒體等結(jié)構(gòu)毒害較大[22,27].咪唑類化合物的結(jié)構(gòu)和陽離子表面活性劑相似,[BMIM]Cl是一端親水(咪唑端)一端親油(烷基端)的兩親分子.表面活性劑對藻類的作用主要是能引起膜脂結(jié)構(gòu)的破壞和組成的改變[28].[BMIM]Cl對斜生柵藻的影響與表面活性劑的影響類似,通過TEM觀察,[BMIM]Cl引起藻細(xì)胞的質(zhì)壁分離,[BMIM]Cl透過細(xì)胞壁,滲透到含有大量脂類的細(xì)胞膜中,影響了細(xì)胞的正常生長.[BMIM]Cl進(jìn)入細(xì)胞后破壞了葉綠體的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致葉綠體的片層結(jié)構(gòu)斷裂,葉綠素含量下降,影響了光合作用的進(jìn)行.脂質(zhì)球體的變化可以反映出細(xì)胞在脅迫條件下的受傷害程度[29],TEM觀察發(fā)現(xiàn) 80mg/L[BMIM]Cl處理的藻細(xì)胞葉綠體內(nèi)分布有脂質(zhì)球體(圖 4B3和 4B4).線粒體作為有氧呼吸產(chǎn)生能量的主要場所,是對各種損傷最為敏感的細(xì)胞器之一,為了獲得代謝所需的能量,線粒體承擔(dān)了更重的任務(wù)從而引發(fā)了病變.本研究觀察到線粒體嵴數(shù)量的減少以及嵴腫脹,[BMIM]Cl可能對藻細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換系統(tǒng)產(chǎn)生影響,從而阻礙物質(zhì)和能量的傳遞,影響藻正常的生長代謝.

3 結(jié)論

3.1 在試驗(yàn)濃度范圍(0,20,40,80,120,180,250mg/L)內(nèi),隨著濃度的增大,[BMIM]Cl對斜生柵藻的生長抑制作用增強(qiáng),導(dǎo)致藻類葉綠素含量下降.

3.2 [BMIM]Cl低濃度(20mg/L)處理組,斜生柵藻的SOD與CAT活性增大,表現(xiàn)出對[BMIM]Cl處理的氧化應(yīng)激反應(yīng);隨著[BMIM] Cl處理濃度的增加,斜生柵藻的SOD與CAT活性下降.

3.3 [BMIM]Cl破壞了斜生柵藻細(xì)胞膜,隨化合物濃度增加細(xì)胞通透性增強(qiáng).

3.4 暴露于80mg/L[BMIM]Cl溶液中,斜生柵藻細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)受到了影響,造成質(zhì)壁分離,葉綠體片層斷裂,線粒體嵴數(shù)量減少.

[1] Brennecke J F, Maginn E J. Ionic liquids: Innovative fluids for chemical processing [J]. AIChE Journal, 2001,11(47):2384-2389.

[2] Jastorff B, St?rmann R, Ranke J, et al. How hazardous are ionic liquids? Structure-activity relationships and biological testing as important elements for sustainability evaluation [J]. Green Chemistry, 2003,5(2):136-142.

[3] Pham T P T, Cho C W, Yun Y S. Environmental fate and toxicity of ionic liquids: A review [J]. Water Research, 2010,44(2):352-372.

[4] Bemot R J, Brueseke M A, Evans W M A, et al. Acute and chronic toxicity of imidazolium-based ionic liquids on Daphnia magna [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2005, 24(1):87-92.

[5] Pretti C, Chiappe C, Pieraecini D, et al. Acute toxicity of ionic liquids to the zebra fish (Danio rerio) [J]. Green Chemistry, 2006, 8:238-240.

[6] Luo Y R, Wang S H, Li X Y, et al. Toxicity of ionic liquids on the growth, reproductive ability, and ATPase activity of earthworm [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2010,73(5): 1046-1050.

[7] 盧珩俊,陸 胤,徐冬梅,等.咪唑類離子液體系列對鹵蟲的急性毒性研究 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2011,31(3):454-460.

[8] Pretti C, Chiappe C, Baldetti I, et al. Acute toxicity of ionic liquids for three freshwater organisms: Pseudokirchneriella subcapitata, Daphnia magna and Danio rerio [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2009,72:1170-1176.

[9] Kulacki K J, Lamberti G A. Toxicity of imidazolium ionic liquids to freshwater algae [J]. Green Chemistry, 2008,10:104-110.

[10] 牧 輝,彭新晶,戴 寧,等.離子液體[C8mim]PF6對水生生物的毒性作用 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2009,29(11):1196-1201.

[11] Ma J, Wang S, Wang P W, et al. Toxicity assessment of 40 herbicides to the green alga Raphidocelis subcapitata [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2006,63(3):456-462.

[12] 楊 良,葛 飛,喻方琴,等.十六烷基三甲基氯化銨與熒蒽對小球藻的聯(lián)合毒性及其作用機(jī)制 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2011,31(1): 150-155.

[13] Liu H J, Xiong M Y. Comparative toxicity of racemic metolachlor and S-metolachlor to Chlorella pyrenoidosa [J]. Aquat Toxicology, 2009,93(2/3):100-106.

[14] Jeffrey S W, Humphrey G F. New spectrophotometric quations for determining chlorophyll a, b, c1 and c2 in higher plants and natural phytoplankton [J]. Biochemie und Physiologie der Pflanzen, 1975,167:191-194.

[15] Aebi H. Catalase in vitro [J]. Methods in Enzymology, 1984,105: 121-126.

[16] 陳建勛,王曉峰.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) [M]. 廣州:華南理工大學(xué)出版社, 2002:124-126.

[17] Vigneault B, Percot A, Lafleur M, et al. Permeability changes in model and phytoplankton membranes in the presence of aquatic humic substances [J]. Environmental Science and Technology, 2000,34:3907-3913.

[18] 李俊峰,胡 翔,李春喜.咪唑類ILs對天然水體中斜生柵藻的毒性效應(yīng) [J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2010,33(3):37-40,53.

[19] 廖柏寒,劉 俊,周 航,等.Cd脅迫對大豆各發(fā)育階段生長及生理指標(biāo)的影響 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2010,30(11):1516-1521.

[20] Stajner D, Popovic M, Stanjer M. Herbicide induced oxidative stress in lettuce, beans, pea seeds and leaves [J]. Biologia Plantarum, 2003,47(4):575-579.

[21] Choo K, Snoeijs P, Pedersén M. Oxidative stress tolerance in the filamentous green algae Cladophora glomerata and Enteromorpha ahlneriana [J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2004,298(1):111-123.

[22] Qian H F, Chen W, Sheng G D, et al. Effects of glufosinate on antioxidant enzymes, subcellular structure, and gene expression in the unicellular green alga Chlorella vulgaris [J]. Aquatic Toxicology, 2008,8(4):301-307.

[23] Regel R H, Ferris J M, Ganf G G, et al. Algal esterase activity as a biomeasure of environmental degradation in a freshwater creek [J]. Aquatic Toxicology, 2002,59:209-223.

[24] Brookes J D, Geary S M, Ganf G G, et al. The use of FDA and flow cytometry to assess metabolic activity as anindicator of nutrient status in phytoplankton [J]. Marine and Freshwater Research, 2000,51(8):817-823.

[25] Wen Y Z, Chen H, Shen C S, et al. Enantioselectivity tuning of chiral herbicide dichlorprop by copper: roles of reactive oxygen species [J]. Environmental Science and Technology, 2011,45(11): 4778-4784.

[26] Cai X Y, Liu W P, Sheng G Y. Enantioselective degradation and ecotoxicity of the chiral herbicide diclofop in three freshwater alga cultures [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008,56(6):2139-2146.

[27] 谷 巍,施國新,韓承輝,等.汞、鎘污染對輪葉狐尾藻的毒害 [J].中國環(huán)境科學(xué), 2001,21(4):371-375.

[28] 龔良玉,李雁賓,王修林,等.生物表面活性劑對東海原甲藻生長的影響 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2004,24(6):692-696.

[29] 萬里強(qiáng),石永紅,李向林,等.高溫干旱脅迫下三個多年生黑麥草品種葉綠體和線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化 [J]. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2009, 18(1):25-31.