孫家凱，吳曉嬌，王晶，徐慶陽，謝希賢，陳寧

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)

L-異亮氨酸屬于分支鏈氨基酸，是人體必需氨基酸之一，具有多種生理功能，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及其調(diào)味劑、動(dòng)物飼料、化妝品的制造，尤其是在醫(yī)學(xué)研究和治療中的作用日益受到重視［1］。目前利用微生物生產(chǎn)L-異亮氨酸的方法主要有添加前體發(fā)酵法和直接發(fā)酵法。異亮氨酸產(chǎn)生菌大多由谷氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌及大腸桿菌選育而來。當(dāng)前工業(yè)化生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的菌株為谷氨酸棒桿菌，但傳統(tǒng)誘變育種獲得的L-異亮氨酸高產(chǎn)菌株副生雜酸比較多，尤其是丙氨酸、賴氨酸、蛋氨酸等，這對(duì)后提取高純度L-異亮氨酸造成很大的困難，同時(shí)由于發(fā)酵周期長(zhǎng)(約70～96 h)，易染菌，從而使發(fā)酵成本增加，這也是異亮氨酸價(jià)格高昂的重要原因。由于大腸桿菌遺傳背景清楚，繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制并且容易實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)，因此利用大腸桿菌構(gòu)建能夠生產(chǎn)異亮氨酸的基因工程菌具有廣泛的應(yīng)用前景。

磷酸鹽既能夠控制菌體的DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，也能控制糖的代謝作用、細(xì)胞的呼吸和胞內(nèi)ATP水平［2］。磷酸鹽的含量能夠影響重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒復(fù)制的速率，因而是菌體生長(zhǎng)和目的蛋白表達(dá)量的決定性因素之一［3］。磷酸鹽濃度能夠影響大腸桿菌比生長(zhǎng)速率，而乙酸的生成又與比生長(zhǎng)速率息息相關(guān)，有害代謝物對(duì)重組菌存在抑制作用是影響大腸桿菌高密度發(fā)酵的重要因素，因此控制適宜的磷酸鹽濃度對(duì)提高異亮氨酸產(chǎn)量具有重要意義。在前期實(shí)驗(yàn)以E.coli K12為出發(fā)菌株所構(gòu)建的異亮氨酸工程菌的基礎(chǔ)上，本文研究了磷酸鹽對(duì)菌體生長(zhǎng)、副產(chǎn)物生成、耗氨及產(chǎn)酸等影響，確定了L-異亮氨酸發(fā)酵過程中初始磷酸鹽的濃度以及補(bǔ)加濃度，在達(dá)到高密度培養(yǎng)的同時(shí)實(shí)現(xiàn)L-異亮氨酸的增產(chǎn)。

1 材料和方法

1.1 菌株

E.coli TRFP，該菌株是以E.coli K12為出發(fā)菌株，經(jīng)傳統(tǒng)誘變選育得到SG及α-AB雙重抗性突變株后，轉(zhuǎn)化包含蘇氨酸操縱子及蘇氨酸脫水酶基因的表達(dá)質(zhì)粒pthr101后而得到的L-異亮氨酸工程菌，由天津科技大學(xué)工業(yè)微生物菌種保藏室提供。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 30，酵母粉 10，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 5，KH2PO41，玉米漿20，氯霉素50 mg，pH 7.0 ～7.2，0.75 ×105Pa滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 30，(NH4)2SO44，微量元素混合液 5 mL，MgSO4·7H2O 1，KH2PO42，玉米漿 20，F(xiàn)eSO4·7H2O 100 mg，氯霉素 50 mg，pH 7.0～7.2，0.75×105Pa滅菌15 min。

1.3 培養(yǎng)方法

活化斜面培養(yǎng):37℃恒溫培養(yǎng)36 h。

5 L種子罐(上海保興)培養(yǎng):吸取適量無菌生理鹽水于3支活化斜面中，將所有菌懸液接入裝5 L種子罐中，初始裝液量為3 L，初始通氣量3 L/min;攪拌轉(zhuǎn)速300～500 r/min;通過自動(dòng)流加氨水控制pH值在7.0;培養(yǎng)溫度37℃;以泡敵消泡;待種子培養(yǎng)液OD600為10～20時(shí)，按10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。

30 L發(fā)酵罐(上海保興)發(fā)酵培養(yǎng):按10%接種量將種子液接種于30 L發(fā)酵罐中，初始裝液量為16 μL;初始通氣量3 L/min;攪拌轉(zhuǎn)速500 ～800 r/min;通過自動(dòng)流加氨水控制pH值在7.0;培養(yǎng)溫度37℃;以泡敵消泡;發(fā)酵時(shí)間34 h。

1.4 分析方法

菌體生物量及菌體比生長(zhǎng)速率μ［4］:菌體生物量以菌體干重表示，取10 mL發(fā)酵液，10 000 r/min離心20 min，將菌體用蒸餾水洗滌2次后置于真空干燥箱中80℃干燥至恒重，用分析天平稱重;菌體比生長(zhǎng)速率μ定義為:單位質(zhì)量菌體的瞬時(shí)增量，計(jì)算公式:

其中，X、x均為菌體量(g/L)，t為時(shí)間(h)，μ 為每克菌體在1 h內(nèi)菌體增加的質(zhì)量(g)，μ的單位為h－1。用Origin繪圖軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行插值計(jì)算(時(shí)間間隔為0.1 h)，再用Excel軟件求解不同時(shí)刻的μ。

L-異亮氨酸含量:采用高效液相分析系統(tǒng)測(cè)定。色譜分離條件:Agilent C18(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)，2，4-二硝基氟苯柱前衍生測(cè)定，乙腈與NaAc溶液進(jìn)行梯度洗脫，柱溫33℃，流動(dòng)相流量1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

磷酸鹽、乙酸及NH4+濃度:采用BioProfile 300A Nova(美國(guó)Nova Biomedical公司)生化分析儀測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 磷酸鹽初始濃度對(duì)異亮氨酸分批發(fā)酵的影響

由表1可知，隨著磷酸鹽濃度的增加，最大比生長(zhǎng)速率與生物量明顯增加，但磷酸鹽濃度在8～12 g/L時(shí)最大生物量卻無明顯變化，而高于12 g/L時(shí)反而下降，說明磷酸鹽濃度過高后對(duì)菌體生長(zhǎng)有一定的抑制作用。對(duì)于產(chǎn)酸而言，在磷酸鹽濃度為4 g/L時(shí)得到最大產(chǎn)量，但與磷酸鹽濃度為2 g/L時(shí)差別不大，且高于4 g/L后產(chǎn)量下降?？梢钥闯?，在一定范圍內(nèi)，隨著磷酸鹽濃度的增加產(chǎn)酸也相對(duì)增加，但過高后產(chǎn)酸呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。另外，磷酸鹽初始濃度越大，菌體進(jìn)入衰退期的時(shí)間越早，而發(fā)酵周期也越短。

表1 不同初始磷酸鹽濃度對(duì)異亮氨酸發(fā)酵的影響

2.2 磷酸鹽對(duì)比生長(zhǎng)速率的影響

發(fā)酵過程中比生長(zhǎng)速率μ是一個(gè)重要的參數(shù)，它能夠影響細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)［6］、質(zhì)粒的拷貝數(shù)、副產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)生。在不同的比生長(zhǎng)速率下，雖然mRNA數(shù)量無明顯差異，核糖小體的數(shù)量卻隨著比生長(zhǎng)速率的增大而增大，從而決定了細(xì)胞在高比生長(zhǎng)速率下的蛋白合成能力更強(qiáng)［7］。而低比生長(zhǎng)速率下能夠有效地減少乙酸生成和降低耗氧速率，從而更容易達(dá)到高密度培養(yǎng)。因此發(fā)酵過程需控制適宜的比生長(zhǎng)速率，在達(dá)到高密度發(fā)酵培養(yǎng)的同時(shí)實(shí)現(xiàn)異亮氨酸的高產(chǎn)。

圖1 不同磷酸鹽濃度下細(xì)菌比生長(zhǎng)速率的變化曲線

由圖1可知，發(fā)酵過程中，不同磷酸鹽濃度下E.coli TRFC的比生長(zhǎng)速率存在顯著差異。隨著磷酸鹽濃度的增加，菌體的延滯期明顯縮短，細(xì)胞比生長(zhǎng)速率達(dá)到最大值的時(shí)間逐漸縮短。當(dāng)磷酸鹽濃度為8 g/L時(shí)，7 h達(dá)到最大值0.35/h，然后迅速降低，18 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期。在較高磷酸鹽濃度4 g/L與8 g/L時(shí)比生長(zhǎng)速率差異較小，但前者的最大比生長(zhǎng)速率較后者小，大約8 h達(dá)到最大值0.30/h，約22 h才進(jìn)入穩(wěn)定期。而在低磷酸鹽濃度2 g/L與1 g/L時(shí)最大比生長(zhǎng)速率差異較小(約0.27/h)，且兩者達(dá)到最大比生長(zhǎng)速率均在10 h之后，然后緩慢下降，但是磷酸鹽濃度為1 g/L時(shí)，其延滯期最長(zhǎng)，約4～5 h后才進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且其最大生物量也最小，如圖2。由此可知，在高濃度磷酸鹽條件下，雖然可以得到較大的生物量，但是其后期發(fā)酵無力，衰退較快。因此，需控制適當(dāng)?shù)偷牧姿猁}濃度(2～4 g/L)既保證得到較大生物量又能延緩衰退。

圖2 不同磷酸鹽濃度下生物量的變化曲線

2.3 磷酸鹽補(bǔ)加對(duì)異亮氨酸發(fā)酵的影響

由L-異亮氨酸在磷酸鹽2 g/L時(shí)發(fā)酵過程曲線(圖3)可知，0～4 h為延滯期，4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，16 h后既進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期，菌體生長(zhǎng)明顯減緩;而異亮氨酸從6 h開始積累，16 h后產(chǎn)酸趨勢(shì)明顯減緩，而此時(shí)發(fā)酵液中磷酸鹽也幾乎耗盡，后期發(fā)酵無力。因此通過補(bǔ)加2 g/L的磷酸鹽以強(qiáng)化后期發(fā)酵。從圖4可以看出，未添加磷酸鹽時(shí)，25 h左右菌體進(jìn)入穩(wěn)定期，磷酸鹽初始濃度為2 g/L與4 g/L時(shí)達(dá)到的最大生物量分別為31.9 g/L和36.5 g/L，而在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中后期添加一定濃度(2 g/L)的磷酸鹽會(huì)發(fā)生二次生長(zhǎng)現(xiàn)象，能夠在一定程度上減緩菌體衰退，菌體22 h后才進(jìn)行穩(wěn)定期，且其最大生物量達(dá)到39.7 g/L，較前兩者菌體生物量分別提高24.5%和8.7%。異亮氨酸產(chǎn)量也較前兩者分別提高12.7%和9.2%。

圖3 磷酸鹽濃度為2 g/L時(shí)L-異亮氨酸發(fā)酵過程曲線

圖4 添加2 g/L KH2PO4時(shí)對(duì)異亮氨酸發(fā)酵的影響

2.4 磷酸鹽對(duì)副產(chǎn)物乙酸的影響

乙酸是大腸桿菌高密度培養(yǎng)過程中的主要的抑制性代謝副產(chǎn)物，發(fā)酵過程中乙酸的過多積累會(huì)導(dǎo)致菌體過早地衰老、自溶、比活性較低。高濃度的乙酸能減緩生長(zhǎng)速率，能夠在很大程度上降低補(bǔ)料分批培養(yǎng)中的生物量，乙酸的積累也是影響重組蛋白表達(dá)的重要因素［8］。Koh發(fā)現(xiàn)，乙酸對(duì)重組蛋白細(xì)胞的抑制作用比野生型細(xì)胞更為明顯［9］;據(jù)報(bào)道［10］，乙酸濃度大于5 g/L時(shí)就能減緩生長(zhǎng)速率，降低生物量，當(dāng)培養(yǎng)液中乙酸濃度大于12 g/L時(shí)外源蛋白的表達(dá)完全被抑制。

圖5 不同磷酸鹽濃度下乙酸的變化曲線

由圖5可知，在發(fā)酵初期，發(fā)酵液中幾乎沒有乙酸的積累，但是，在菌體進(jìn)行對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，乙酸的積累均急劇增加，并且磷酸鹽濃度越高積累的乙酸速度越快。其中，磷酸鹽濃度為1 g/L和2 g/L時(shí)乙酸生成趨勢(shì)大致相同。初始磷酸鹽濃度分別為1 g/L、2 g/L、4 g/L和8 g/L時(shí)，積累乙酸的最大濃度依次為174.2 mmol/L、197.1 mmol/L、221.5 mmol/L 和239.8 mmol/L，這說明初始磷酸鹽濃度越高，越容易積累高濃度的乙酸。另外當(dāng)磷酸鹽濃度低于4 g/L時(shí)，菌體進(jìn)入穩(wěn)定期后乙酸濃度均有不同程度的下降，而磷酸鹽濃度為8 g/L時(shí)，后期乙酸濃度無明顯下降，這可能是由于在較低的磷酸鹽濃度下，發(fā)酵后期菌體活力相對(duì)較強(qiáng)，能夠消耗一部分的乙酸，而高濃度的磷酸鹽條件下后期發(fā)酵環(huán)境惡劣，菌體活力弱，對(duì)乙酸的耐受能力更差，因而菌體分解利用乙酸的能力較弱。

在大腸桿菌發(fā)酵過程中，乙酸產(chǎn)生主要有兩個(gè)原因，即葡萄糖的攝入速率大于TCA循環(huán)的周轉(zhuǎn)能力和通過呼吸鏈和氧化磷酸化的電子傳遞受到限制［11］。由圖2可知，隨著磷酸鹽濃度的增加，發(fā)酵過程中菌體的最大比生長(zhǎng)速率也相應(yīng)增加。而在高比生長(zhǎng)速率時(shí)，大腸桿菌僅靠氧化代謝不能提供足夠的能量，必須通過乙酸生成途徑儲(chǔ)備ATP和NADH2以滿足代謝能量需求［12］;同時(shí)當(dāng)磷酸鹽濃度增加時(shí)，糖酵解途徑的活性大幅度提高，菌體利用葡萄糖的速率也相應(yīng)增加。因此，在高磷酸鹽濃度的情況下雖然具有較高的比生長(zhǎng)速率，但是易產(chǎn)生大量副產(chǎn)物乙酸，而乙酸的積累影響生物量的進(jìn)一步增加，同時(shí)外源基因的表達(dá)也受到嚴(yán)重影響。

2.5 磷酸鹽對(duì)濃度的影響

大腸桿菌高密度發(fā)酵過程中，穩(wěn)定的pH是保證菌體最佳生長(zhǎng)狀態(tài)的必要條件，代謝副產(chǎn)物乙酸和發(fā)酵產(chǎn)物異亮氨酸的積累，都會(huì)使發(fā)酵液的pH值下降，因而會(huì)消耗大量的氨水以維持pH的穩(wěn)定，但是大腸桿菌對(duì)銨的利用能力有限，當(dāng)濃度的增加至一定濃度后會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生毒害作用。Thompson認(rèn)為濃度高于170 mmol/L時(shí)會(huì)抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，濃度高于480 mmol/L時(shí)菌體的生長(zhǎng)完全停止［13］。

圖6 不同磷酸鹽濃度下濃度的變化曲線

3 討論

重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)能夠提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率，提高設(shè)備利用率從而降低生產(chǎn)成本。但是在該技術(shù)實(shí)際應(yīng)用中卻遭遇諸多問題，其中最為嚴(yán)重的就是培養(yǎng)過程中菌體過早地衰老和外源基因表達(dá)率低，這主要是由于有害代謝物對(duì)重組菌存在抑制作用。

將菌體的比生長(zhǎng)速率控制在一定的閥值內(nèi)，可有效減少乙酸的生成［15］，而利用大腸桿菌表達(dá)外源蛋白通常需要較高的比生長(zhǎng)速率以獲得高的表達(dá)水平［16］，因此可通過基因工程手段消除乙酸的產(chǎn)生。Cho等通過修改大腸桿菌染色體上mLc基因的啟動(dòng)子區(qū)域，從而使乙酸的產(chǎn)生降低了50%，而重組蛋白的表達(dá)量也大大提高［17］。Aristidou等通過表達(dá)枯草芽孢桿菌的乙酰乳酸合成酶，從而將多余的丙酮酸轉(zhuǎn)化成毒性較更小的副產(chǎn)物3-羥基丁酮，最終在將乙酸生成減少75%的同時(shí)，重組蛋白的表達(dá)量提高了兩倍［18］。在發(fā)酵初期若磷酸鹽過多，會(huì)導(dǎo)致前期菌體生長(zhǎng)旺盛，后期發(fā)酵無力易衰退的現(xiàn)象，同時(shí)乙酸也會(huì)過多積累，而濃度隨著乙酸濃度的增加而增加，兩者相互影響，從而加劇菌體衰退。而細(xì)胞環(huán)境中濃度增加，降低了細(xì)胞對(duì)能量的利用效率，使細(xì)胞能量供應(yīng)不足，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受阻，菌體生物量下降［19］。通過基因工程手段減少副產(chǎn)物乙酸的生成，然后提高發(fā)酵初期磷酸鹽的濃度，從而提高發(fā)酵過程中的比生長(zhǎng)速率，在得到較高的生物量的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)外源蛋白的大量表達(dá)。

本文研究表明，在發(fā)酵初期降低磷酸鹽濃度(KH2PO4濃度控制在2 g/L)，中后期補(bǔ)加2 g/L KH2PO4，可顯著減緩菌體衰退，有效避免了高濃度磷酸鹽條件下副產(chǎn)物乙酸的過多積累，明顯提高了生物量和異亮氨酸的產(chǎn)量，這對(duì)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)L-異亮氨酸提供了理論依據(jù)并具有一定實(shí)用價(jià)值。

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