田徽，阮期平，賴恩陽，歐平，李強

1(綿陽師范學(xué)院分子生物學(xué)與生物制藥重點實驗室，四川綿陽，621000)2(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室，四川 成都，611137)3(綿陽羌山源中藥科技有限公司，四川綿陽，621000)

大孔樹脂純化馬蘭總黃酮樹脂吸附特性及工藝的研究

田徽1，2，阮期平1，賴恩陽1，歐平3，李強3

1(綿陽師范學(xué)院分子生物學(xué)與生物制藥重點實驗室，四川綿陽，621000)2(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室，四川 成都，611137)3(綿陽羌山源中藥科技有限公司，四川綿陽，621000)

研究大孔樹脂純化馬蘭總黃酮樹脂吸附特性及工藝條件及參數(shù)。文中分別進行靜態(tài)吸附、靜態(tài)解吸、靜態(tài)吸附動力學(xué)過程(Lagergren準(zhǔn)一級動力學(xué)方程)、靜態(tài)吸附等溫曲線(Langmuir和Freundich等溫吸附方程)、動態(tài)吸附實驗，從7種大孔樹脂中篩選用于馬蘭總黃酮分離的最佳樹脂，并系統(tǒng)研究最佳大孔樹脂分離純化的吸附性能和最優(yōu)洗脫參數(shù)。結(jié)果表明:D101型大孔樹脂為分離馬蘭黃酮類組分最佳樹脂，其分離的最佳工藝為總黃酮濃度為9.36 mg/mL的樣液，以3 BV/h的流速，控制pH值為4～5上柱，用75%乙醇以3 BV/h用量進行洗脫，可獲得樣品總黃酮純度達70%以上。

馬蘭，黃酮類組分，大孔樹脂

馬蘭(Kalimeris indica(L.)Sch.Bip)為常見藥食兩用蔬菜，又名馬蘭頭、路邊菊、泥鰍串等。特別在我國北方及江浙一帶，是早春市場的珍稀蔬菜，市場需求量大。馬蘭在我國應(yīng)用歷史悠久［1－4］。課題組前期研究也證明了馬蘭具有顯著的健胃作用，而且通過進一步研究發(fā)現(xiàn)馬蘭黃酮類組分為其健胃作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一［5］。為了開發(fā)馬蘭黃酮類組分，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，本實驗采用大孔樹脂吸附技術(shù)分離純化馬蘭黃酮類組分，現(xiàn)將有關(guān)工藝研究報道如下。

1 材料

UltroSPec 3300 pro紫外可見分光光度計(美國安瑪西亞公司);Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司);NKA-9、DM-130、D-101、DM-301、AB-8、HPD-100、X-5大孔吸附樹脂(天津市海光化工有限公司提供，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號:津Q/HG3790—91)。

馬蘭(采于綿陽師范學(xué)院內(nèi)，經(jīng)綿陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院羅明華教授鑒定為植物Kalimeris indica(L.)Sch.Bip);蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號100080－200707);其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純(成都科龍化學(xué)試劑廠)。

2 方法

2.1 馬蘭提取液的制備

采摘新鮮馬蘭植物全草，置60℃下真空干燥至恒重(3 h)，粉碎，過藥典2號篩［L1］(24目)。稱取一定量馬蘭粉末，采用固液比1∶30、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%提取90 min，過濾，重復(fù)2次，合并濾液。濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至無醇味，60℃真空干燥后即得馬蘭黃酮類組分的粗制品，并將該粗制品配置成一定濃度的樣液，供純化使用。

2.2 馬蘭黃酮類組分含量測定方法

2.2.1 對照品溶液的制備。

精密稱取經(jīng)120℃恒溫干燥至恒重的蘆丁對照品10 mg，置50 mL的量瓶中，加適量乙醇，用超聲處理使其全部溶解，放冷，然后再加適量乙醇至刻度線，搖勻即得所需要的對照品溶液(每1 mL中含無水蘆丁0.2 mg)。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。

精密量取對照品溶液 2、4、6、8、10、12 mL，將其分別置于50 mL的量瓶中，然后分別加水至12 mL，再分別滴加5%亞硝酸鈉溶液2mL，搖勻，放置6 min，然后再分別滴加10% 硝酸鋁溶液2 mL，搖勻，放置6 min，再滴加4%氫氧化鈉試液20 mL，最后再加水至刻度線，搖勻，放置15 min，用相應(yīng)試劑作為［L2］空白對照組，然后立即照紫外-可見分光光度法，設(shè)定波長在500 nm處測定各組對照品溶液的吸光度，記錄實驗所得各組吸光度［6］。以濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，各組所測的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)

曲線所求得的回歸曲線方程為A=10.46c－0.000 9，R2=0.999 5(n=7)?？傸S酮以蘆丁計在0.008～0.048 mg/L線性關(guān)系良好。

2.3 樹脂的選擇

2.3.1 樹脂的前處理

稱取干大孔樹脂 NKA-9、DM-130、D-101、DM-301、AB-8、HPD-100、X-5，分別用丙酮連續(xù)洗滌數(shù)次，加適量水至無白色渾濁現(xiàn)象出現(xiàn)為止，再用蒸餾水洗滌至無有機溶劑味，用配制好的10%的NaCl溶液浸泡24 h，隨后用蒸餾水沖洗至中性，再用已配制好的1 mol/mL的鹽酸溶液沖洗，最后再用蒸餾水洗至中性即可。

2.3.2 靜態(tài)吸附及靜態(tài)解吸

準(zhǔn)確稱取7種已經(jīng)處理好的大孔樹脂各1 g置于100 mL的具塞磨口三角瓶中，然后分別加入馬蘭總黃酮水溶液50 mL(配制成總黃酮的含量為5.39 mg/mL)，置往復(fù)式水浴恒溫振蕩儀上振蕩，持續(xù)24 h，充分吸附后抽濾，分別量取各大孔樹脂吸附后的溶液0.5 mL置于50 mL的量瓶中，按2.2.2法測定含量，最后按以下公式計算各種大孔樹脂對馬蘭總黃酮的吸附量以及吸附率。將靜態(tài)吸附的樹脂過濾抽干后，加入50 mL 75%的乙醇溶液，然后將具塞磨口三角瓶置于旋轉(zhuǎn)搖床上振蕩24 h，充分解吸后再抽濾，再分別量取各大孔樹脂解吸附后的溶液0.5 mL置于50 mL的量瓶中，按2.2.2法測定含量，最后按以下公式計算各種樹脂對馬蘭總黃酮的解吸率［7］。

其中:c0起始濃度(mg/mL)，c1為剩余濃度(mg/mL)，V0為吸附溶液體積(mL)，m 為樹脂質(zhì)量(g)，c2為解吸液濃度(mg/mL)，V1為解吸液體積(mL)。

2.3.3 靜態(tài)吸附等溫曲線

準(zhǔn)確稱取靜態(tài)吸附和解吸率特性較好的D-101及HPD-100樹脂，各5份，每份1.0 g，裝入100 mL的具塞錐形瓶中，加入不同濃度的馬蘭總黃酮水溶液50 mL，置于25℃(298 K)往復(fù)式水浴恒溫振蕩器上振搖24 h，過濾，測定吸附后溶液的濃度，計算樹脂的吸附量。根據(jù)平衡后吸附量與水溶液中總黃酮平衡濃度之間的關(guān)系，利用Langmuir和Freundich等溫吸附方程的線性形式對實驗結(jié)果進行擬合［8，9］，繪制不同樹脂吸附馬蘭總黃酮的等溫吸附曲線并計算相關(guān)參數(shù)。

其中:Qe為平衡吸附量(mg/g)，ce為平衡濃度(mg/mL)，Qm為飽和吸附量(mg/g)，KL為結(jié)合常數(shù)(mL/mg);n、KF為等溫吸附特征常數(shù)。KL可以評價吸附量的大小，n則可描述等溫線的變化趨勢。

2.3.4 靜態(tài)吸附動力學(xué)

準(zhǔn)確稱取靜態(tài)吸附和解吸率特性較好的D-101及HPD-100樹脂，每份1.0 g，裝入100 mL具塞錐形瓶中，加入馬蘭總黃酮水溶液50 mL，置往復(fù)式水浴恒溫振蕩器上振蕩，然后分別再測定各樹脂在t時刻內(nèi)(t=0.5，1，2，4，8，16，24 h)時達到的吸附量。以 Qt對 t作圖，并依照Lagergren準(zhǔn)一級動力學(xué)方程，擬合－ln(1－ Qt/Qe)與 t的曲線，并計算平衡速率常數(shù) K［［8，9］。

其中:Qe為平衡吸附量(mg/g)，Qt為時間t時的吸附量(mg/g)，K平衡速率常數(shù)(h－1)。

2.3.5 動態(tài)吸附與解析

取D-101及HPD-100樹脂濕法裝于1 cm×20 cm的柱內(nèi)(計算柱床體積=半徑2×π×樹脂層高)，裝柱高度為12.8 cm，加馬蘭總黃酮水溶液100 mL(按2.2.2法已知測定含量)于柱頂，先用水100 mL沖洗，再用75%乙醇100 mL洗脫［10］。分別收集殘留液，水洗液和乙醇洗脫液，測定吸光度，計算總黃酮含量，以總黃酮的比吸附量(mg/mL)，解吸率(%)為評價指標(biāo)，篩選最佳樹脂。

其中:V為樹脂濕體積(mL);M上為上柱液中成分的質(zhì)量(mg);M殘為過柱流出液中成分的質(zhì)量(mg);M水洗為水洗脫下來成分的質(zhì)量(mg);M醇洗脫為乙醇洗脫成分的質(zhì)量(mg)。

2.4 樹脂柱分離條件的考察

考察影響大孔樹脂純化過程中的主要因素即樣液［L3］濃度、上樣流速、pH 等的最優(yōu)條件［11－12］。

2.4.1 上樣濃度的考察

以篩選出的D101型大孔樹脂為馬蘭總黃酮的純化載體，采用濕法裝柱。層析柱的規(guī)格為(2 cm ×20 cm)，裝柱高度為10 cm。取總黃酮濃度為2.34、4.68、7.02、9.36、11.70、14.04 mg/mL 的樣液各 50 mL，以3 BV/h的流速，分別加入6根同樣的樹脂柱中。吸附完全后，用5BV去離子水沖洗，再用5 BV濃度75%乙醇以3 BV/h的流速洗脫，測定回收率，選擇最適上樣濃度。(1BV=31.4 mL)

回收率/%=(乙醇洗脫所得總黃酮的質(zhì)量/上樣前總黃酮的質(zhì)量)×100

2.4.2 上樣量的考察(泄漏曲線)

以D101型大孔樹脂裝柱(2 cm ×20 cm)，裝柱高度為10 cm。取總黃酮濃度為9.36 mg/mL的樣液若干，以3 BV/h的速度上樣，每10 mL為一個收集段，檢測每段收集液中總黃酮濃度，繪制泄漏曲線。

2.4.3 上樣速率的考察

以D101型大孔樹脂裝柱(2 cm ×20 cm)，裝柱高度為10 cm。取總黃酮濃度為9.36 mg/mL的樣液100 mL，分別以 1 BV/h、2 BV/h、3BV/h、4BV/h、5 BV/h的流速加入到5根同樣的樹脂柱中。吸附完全后，用5BV去離子水沖洗，再用濃度75%乙醇以3 BV/h的流速洗脫，乙醇用量為5 BV，測定回收率。

2.4.4 樣液pH值的考察

以D101型大孔樹脂裝柱(2 cm ×20 cm)，裝柱高度為10 cm。取總黃酮濃度為9.36 mg/mL的樣液100 mL。然后分別調(diào) pH 值至4～5、6～7、8～9、10 ～11、12～13以3 BV/h的流速加入到5根同樣的樹脂柱中。吸附完全后，用5 BV去離子水沖洗，再用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇以3 BV/h的流速洗脫，乙醇用量為5 BV，測定回收率。

2.4.5 乙醇洗脫濃度的考察

以D101型大孔樹脂裝柱(2 cm ×20 cm)，裝柱高度為10 cm。取總黃酮濃度為9.36 mg/mL的樣液100 mL，以3 BV/h的流速上柱，吸附完全后，用5BV去離子水沖洗。分別用濃度45%、55%、65%、75%、85%的乙醇溶液對按以上方法上樣的5根樹脂柱進行洗脫，洗脫速率為3 BV/h，乙醇用量為5 BV，測定其回收率。

2.4.6 洗脫速率的考察

以D101型大孔樹脂裝柱(2 cm ×20 cm)，裝柱高度為10 cm。取總黃酮濃度為9.36 mg/mL的樣液100 mL，以3 BV/h的流速上柱，吸附完全后，用5BV去離子水沖洗。用濃度75%的乙醇溶液分別以按1、2、3、4、5 BV/h的速率對按以上方法上樣的5根樹脂柱進行洗脫，乙醇用量為5 BV，測定其回收率。

2.4.7 洗脫體積的考察

以D101型大孔樹脂裝柱(2 cm ×20 cm)，裝柱高度為10 cm。取總黃酮濃度為9.36 mg/mL的樣液100 mL，以3 BV/h的流速上柱，吸附完全后。用75%乙醇，以3 BV/h的速度洗脫，每10 mL一個收集段收集洗脫液，檢測每段收集液中總黃酮濃度，繪制洗脫曲線。

2.5 工藝驗證實驗

以D101型大孔樹脂裝柱(2 cm ×20 cm)，裝柱高度為10 cm。根據(jù)以上分離條件篩選實驗結(jié)果，即:總黃酮濃度為9.36 mg/mL的樣液100 mL，以3 BV/h的流速，控制pH值為4～5上柱，5BV去離子水沖洗后，用75%乙醇100 mL以3 BV/h用量進行洗脫。收集洗脫液，在60℃真空干燥后即得馬蘭總黃酮的精制品，稱重，并按2.2.2法測定其總黃酮純度。

3 結(jié)果

3.1 樹脂篩選實驗

3.1.1 靜態(tài)吸附及靜態(tài)解吸結(jié)果

靜態(tài)吸附及靜態(tài)解吸結(jié)果見下表1。

表1 七種大孔吸附樹脂對馬蘭黃酮類組分的靜態(tài)吸附及靜態(tài)解吸結(jié)果

實驗結(jié)果顯示D-101及HPD-100樹脂吸附率及解析率均較好。因此選擇這二者進行下一步實驗。

3.1.2 靜態(tài)吸附等溫曲線

靜態(tài)吸附等溫曲線實驗結(jié)果如下表2、圖1、圖2。

表2 25℃(298 K)下等溫吸附方程及參數(shù)

圖1 Langmuir等溫吸附線

圖2 Freundich等溫吸附線

由以上結(jié)果可以看出馬蘭黃酮類組分在的D-101及HPD-100樹脂上的吸附基本符合Langmuir和Freundich等溫吸附方程。而從相關(guān)系數(shù)比較看，選用Langmuir描述更佳。根據(jù)Langmuir等溫吸附模型的假定，可初步推測這兩種樹脂大孔樹脂對馬蘭黃酮類組分的吸附呈單分子吸附。Freundich模型的等溫吸附特征常數(shù)n值介于2～10，說明馬蘭黃酮類組分在這2種樹脂上的吸附容易實現(xiàn)。

3.1.3 靜態(tài)吸附動力學(xué)

靜態(tài)吸附動力學(xué)結(jié)果如下表3、圖3、圖4。

表3 Lagergren準(zhǔn)一級動力學(xué)方程及參數(shù)

圖3 吸附動力曲線

圖4 Lagergren曲線

由以上結(jié)果可以看出，D-101及HPD-100樹脂的R2值均在0.99以上，說明液膜擴散是2種樹脂的控制速率步驟。平衡速率常數(shù)K顯示，D-101樹脂吸附速率略高于HPD-100樹脂。

3.1.4 動態(tài)吸附與解析

動態(tài)吸附與解析結(jié)果如下表4。

表4 D-101、HPD-100兩種大孔樹脂的動態(tài)吸附篩選實驗結(jié)果

由以上結(jié)果可以看出D-101型與HPD-100型2種大孔樹脂對馬蘭中的黃酮類組分都具有比較好的吸附能力及解吸能力，二者相較D-101型樹脂在比吸附量及解吸率上都優(yōu)于HPD-100型樹脂。因此選擇D-101型樹脂為分離馬蘭中的黃酮類組分的最優(yōu)樹脂。

3.2 工藝篩選結(jié)果

3.2.1 上樣濃度

上樣濃度實驗結(jié)果見表5。

表5 上樣濃度的影響

由以上結(jié)果可以看出上樣濃度在9.36 mg/mL時回收率較高，繼續(xù)提高上樣濃度回收率有所下降，故選擇最適上樣濃度為9.36 mg/mL。

3.2.2 上樣量

上樣量實驗結(jié)果見圖5。

圖5 上樣量的影響

由以上結(jié)果可以看出當(dāng)上樣體積達到50 mL后開始出現(xiàn)滲漏。滲漏液的總黃酮含量隨上樣體積增加而上升，當(dāng)上樣體積達到100 mL時，滲漏液濃度接近上樣濃度，說明樹脂基本達到飽和。

3.2.3 上樣速率

上樣速率實驗結(jié)果見表6。

表6 上樣速率的影響

由以上結(jié)果可以看出當(dāng)上樣速率對回收率影響差異不大，以3BV/h上樣略優(yōu)。

3.2.4 樣液pH值

樣液pH實驗結(jié)果見表7

表7 樣液pH值的影響

由以上結(jié)果可以看出樣液pH值4～5的條件下上樣回收率較高。

3.2.5 乙醇洗脫濃度

乙醇洗脫濃度實驗結(jié)果見表8。

表8 乙醇洗脫濃度實驗結(jié)果

由以上結(jié)果可以看出以75%的乙醇進行洗脫，回收率較高。

3.2.6 洗脫速率

洗脫速率實驗結(jié)果見表9。

表9 乙醇洗脫速率實驗結(jié)果

由以上結(jié)果可以看出以3 BV/h的速率進行洗脫，回收率較高。

3.2.7 洗脫體積

洗脫體積實驗結(jié)果見圖6。

圖6 洗脫體積的影響

由以上結(jié)果可以看出當(dāng)洗脫體積達到150mL后基本洗脫完全。

3.3 工藝驗證實驗

工藝驗證實驗結(jié)果如下表10。

表10 驗證實驗結(jié)果

由以上結(jié)果可以看出用D101型大孔樹脂分離馬蘭黃酮類組分其純度可達70%以上。

4 討論

本實驗選用了7種常用于分離黃酮類組分的大孔吸附樹脂進行篩選。通過靜態(tài)吸附、靜態(tài)解吸初步實驗實驗，課題組首先確定了D-101型與HPD-100型兩種大孔吸附樹脂對馬蘭黃酮類組分的吸附及分離效果較好。AB-8型大孔吸附樹脂的吸附量雖然最大，但是AB-8型大孔吸附樹脂洗脫效果較差，故不予選擇。進一步對D-101型和HPD-100型2種大孔吸附樹脂進行靜態(tài)等溫曲線、靜態(tài)吸附動力學(xué)實驗以及動態(tài)篩選實驗。二者比較D-101型樹脂各項指標(biāo)均優(yōu)于HPD-100型樹脂，因此最終選擇D-101型樹脂為分離載體。分析其吸附機理，D-101型樹脂自身極性較弱，其對馬蘭黃酮類組分吸附力較強，可以推斷馬蘭黃酮類組分極性基團可能較少。

通過對影響D-101型大孔樹脂吸附及解吸的各種因素系統(tǒng)研究，最后確定了大孔樹脂分離馬蘭黃酮類組分的最佳工藝，該工藝重復(fù)性良好，產(chǎn)品純度較高，可為日后研究馬蘭抗胃潰瘍機理以及大規(guī)模開發(fā)馬蘭奠定基礎(chǔ)。

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Studies on Adsorption Characteristics and Purification Process of Flavonoids From Kalimeris indica(L.)Sch.Bip by Macroreticular Resin

Tian Hui1，2，Ruan Qi-ping1，Lai En-yang1，Ou Ping3，Li Qiang3
1(Key Laboratory for Molecular Biology and Biopharmaceutic，Mianyang Normal University，Mianyang 621000，China)2(Department of Chinese Materia Medica，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Sichuan Chengdu 611137，China)3(Mianyang Qiangshanyuan Pharmaceutical Co.Ltd，Mianyang 621000，China)

To investigate the adsorption characteristics and purification process of the flavonoids from Kalimeris indica by macroreticular resin.The static capacity absorption，static capacity desorption，static adsorption dynamics(quasi－order kinetic equation of Lagergren)，static adsorption isothermal(Langmuir and Freundich)，dynamic absorption ratio and dynamic elution ratio of seven types of macroreticular resin were studied and compared in order to find the best one，and the adsorption and desorption performances of the best one were studied in detail.The type of D101 resin gave the best effect of separation with the sampling rate 3 BV/h and concentrations of 9.36 mg/mL in pH 4－5，and the concentration of elution was 75%ethanol with eluting velocity 3 BV/h.The purity of total flavonoids in the product was up to 70%，and the purification process was feasible.

Kalimeris indica(L.)Sch.Bip，flavonoids，macroreticular resin

碩士研究生。

*四川省科技支撐計劃項目項目(2010SZ0245);四川省教育廳自然科學(xué)科研項目(10ZC030));綿陽師范學(xué)院自然科學(xué)科研項目(MA2009015)

2011－07－06，改回日期:2011－0－