孟凡冰，李云成，張淑蓉，曾曉漫，鐘耕，2

1(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400716) 2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)

靈芝孢子多糖提取工藝優(yōu)化*

孟凡冰1，李云成1，張淑蓉1，曾曉漫1，鐘耕1，2

1(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400716) 2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)

采用響應(yīng)面分析法對(duì)靈芝孢子多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化?？疾?個(gè)變量(水料比、超聲溫度、微波時(shí)間)對(duì)靈芝孢子多糖提取率的影響，并通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)法確定靈芝孢子多糖提取技術(shù)的最佳工藝條件為水料比20∶1，超聲提取時(shí)間為55 min，微波(200 W，60℃)提取時(shí)間20 min，在此條件下測(cè)得多糖的提取率為2.23%。

靈芝孢子，響應(yīng)面分析法，多糖，提取

靈芝(Ganoderma)，是擔(dān)子菌綱多孔菌科(Polyporaceae)靈芝屬(Ganodelma)真菌赤芝(G.lucidum·karst)和紫芝(G.japonicrn L Loyd)的總稱，靈芝孢子(Ganoderma lueidium sp.)是靈芝生長(zhǎng)成熟期從菌蓋彈射出來(lái)極其細(xì)小的袍子，為靈芝的生殖細(xì)胞，具有靈芝的全部遺傳活性物質(zhì)。它富含蛋白質(zhì)(18.53%)及多種氨基酸(總量為6.1%)，還含有豐富的多糖、萜類、生物堿、維生素等成分。破壁后的靈芝孢子粉具有顯著的藥理作用，它比靈芝實(shí)體具有更強(qiáng)、更全面的作用。靈芝孢子粉在抑制腫瘤、增強(qiáng)免疫力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)靈芝子實(shí)體，療效相當(dāng)于靈芝子實(shí)體的 75 倍［1－2］。

靈芝的多種藥理活性大多和靈芝多糖有關(guān)，目前已分離到的靈芝多糖有200多種。靈芝多糖的主要生物活性有免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤作用、降血糖作用、抗輻射作用、抗氧化作用以及促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)的合成［4－8］。靈芝多糖主要分布于靈芝孢子中，毛泉明等［3］比較栽培靈芝與靈芝孢子粉的有效成分含量，結(jié)果表明，靈芝孢子粉的總多糖是栽培靈芝總多糖1.79倍。

目前靈芝多糖的提取方法主要是傳統(tǒng)的水提醇沉法，還有膜分離法、酶解法、超聲提取方法、微波提取方法等［4］。白在賢等人［8］利用水提醇沉法得到3個(gè)品種破壁靈芝孢子的多糖提取率分別為1.062%、1.076%和1.097%。胡斌杰［10］等人用正交超聲提取，得到靈芝子實(shí)體多糖提取率為1.92%。但這些方法對(duì)靈芝多糖的提取率都相對(duì)較低，并且提取溫度較高，不利于靈芝多糖的活性保持。

為了提高靈芝孢子多糖的提取率，避免部分多糖因提取溫度過(guò)高而受到破壞和分解［11］，最大限度的保持其活性，本文采用超聲波結(jié)合微波提取法，并在相對(duì)較低的溫度下進(jìn)行提取。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用單因素和中心組合實(shí)驗(yàn)，用Box-Behnken軟件繪制響應(yīng)面曲線，并擬合出多元線性回歸方程，以探尋靈芝孢子多糖提取的優(yōu)化參數(shù)，旨在為開(kāi)辟靈芝孢子多糖綜合提取工藝路線提供理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

破壁靈芝孢子粉，破壁率達(dá)到99%，由重慶市生物技術(shù)研究所提供，產(chǎn)地為山東泰安。

1.2 儀器與試劑

PHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司;Eppendorf 5810離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司;KQ-250E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;MAS-Ⅱ型常壓微波萃取儀，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司;SHZ-D(Ш)型循環(huán)水多用真空泵，鄭州市榮陽(yáng)華盛儀器廠;R502B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本Shimadzu公司。

無(wú)水乙醇、硫酸、苯酚等所用試劑均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取工藝流程

破壁靈芝孢子粉在50℃下烘干至恒重→稱取1g樣品(精確到0.001g)→體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸提24 h脫脂和除去低聚糖→真空抽濾→取濾渣按水料比加水配料→超聲處理→微波處理(200 W，60℃)→真空抽濾→濾液60℃真空濃縮→濃縮物用95%乙醇4℃醇沉12 h→離心分離(6 000 r/min，15 min)→沉

淀物用50 g水溶解稀釋→取1 mL測(cè)定多糖含量

1.3.2 靈芝孢子多糖的測(cè)定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用苯酚－硫酸法［12－14］測(cè)定靈芝孢子多糖，其多糖提取率計(jì)算公式為:

1.3.3 單因素試驗(yàn)

分別以水料比、超聲時(shí)間、微波時(shí)間為單因素進(jìn)行試驗(yàn)，考察各單因素對(duì)靈芝孢子多糖提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)［15－18］

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，以靈芝孢子多糖含量為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面分析對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析因素及水平表

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)處理重復(fù)3次，以平均值表示，數(shù)據(jù)處理采用Excel和DPS7.05統(tǒng)計(jì)軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)［18－21］

2.1.1 水料比對(duì)多糖提取率的影響

參考有關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)單因素水料比10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，固定超聲時(shí)間 40 min，微波時(shí)間20 min，按照1.3.1工藝流程進(jìn)行測(cè)定，考察水料比對(duì)多糖提取率的影響(見(jiàn)圖1)。

由圖1可知，水料比為20∶1時(shí)多糖的提取率達(dá)到最高值，當(dāng)水料比大于30∶1時(shí)，多糖提取率有所上升，但均低于水料比為20∶1時(shí)的多糖提取率。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，水料比越大，耗時(shí)耗能就越多，也不利于后續(xù)的純化工序。故為了方便下一步的濃縮和提純，本試驗(yàn)選擇水料比為20∶1。2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

由預(yù)試驗(yàn)可知，料液在超聲條件下處理60 min后，其提取液的溫度仍不會(huì)超過(guò)40℃。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)單因素超聲時(shí)間為20，30，40，50，60 min，固定水料比20∶1，微波時(shí)間20 min，按照1.3.1工藝流程進(jìn)行測(cè)定，考察超聲提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響。由圖2可以看出，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的提取率在增大，但是在50 min后，增大效果不明顯(P＞0.05)，為了最大限度的提取到多糖，故將超聲時(shí)間設(shè)定在50 min左右。

圖1 水料比對(duì)靈芝孢子多糖提取率的影響

圖2 超聲時(shí)間對(duì)靈芝孢子多糖提取率的影響

2.1.3 微波時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

在微波條件下，高溫和較大功率容易破壞多糖的結(jié)構(gòu)以及加快多糖降解［20］，從而使多糖活性降低。故本試驗(yàn)選擇微波溫度為60℃，功率為200 W，這樣能有利于保護(hù)多糖。同時(shí)為了降低轉(zhuǎn)移過(guò)程對(duì)多糖造成的損失，在室溫下直接把用于超聲處理的圓底燒瓶放在微波萃取儀中進(jìn)行萃取。設(shè)計(jì)單因素微波時(shí)間5，10，15，20，25 min，固定水料比 20∶1，微波時(shí)間20 min。按照1.3.1工藝流程進(jìn)行測(cè)定，考察微波提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響。由圖3以看出，微波時(shí)間在20 min左右時(shí)多糖的提取率達(dá)到最大，故選擇微波條件為20 min(60℃，200 W)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以水料比X1，超聲時(shí)間X2，微波時(shí)間X3為自變量，以多糖提取率Y為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

圖3 微波時(shí)間對(duì)靈芝孢子多糖提取率的影響

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

表3 響應(yīng)面二次回歸模型方差分析表

由表3可知，模型的一次項(xiàng)X1、X2、X3極顯著，交互項(xiàng) X2X3顯著，X1X2、X1X3不顯著，二次項(xiàng) X12、X2

2、X32都是極顯著，因此各個(gè)具體試驗(yàn)因子與響應(yīng)值都不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

多糖提取率所建的回歸模型P＜0.01是極顯著的，并且該回歸模型的R2=0.975 1調(diào)整系數(shù)R2=0.943 1，模型與實(shí)際試驗(yàn)失擬項(xiàng)P=0.885 9不顯著，說(shuō)明試驗(yàn)擬合較好，試驗(yàn)誤差小，可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)靈芝多糖提取率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

2.2.2 擬合模型的建立

采用Design-Expert程序?qū)Ρ?所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，各因素經(jīng)過(guò)回歸擬合后，解得回歸方程:

2.3 響應(yīng)面圖解

圖4 水料比和超聲時(shí)間對(duì)靈芝孢子多糖提取率影響的響應(yīng)曲面

圖5 水料比和微波時(shí)間對(duì)靈芝孢子多糖提取率影響的響應(yīng)曲面

圖6 超聲時(shí)間和微波時(shí)間對(duì)靈芝孢子多糖提取率影響的響應(yīng)曲面

由圖4～圖6可知，超聲時(shí)間(X2)對(duì)靈芝孢子多糖的提取率影響最顯著，表現(xiàn)為曲線較陡;水料比(X1)與微波時(shí)間(X3)次之，表現(xiàn)為曲線稍為平滑，隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化不大。

通過(guò)軟件分析，多糖提取的最佳條件為水料比為20∶1，超聲時(shí)間為55.88 min，微波時(shí)間為20.48 min，在此條件下多糖提取率的理論值為2.27%，P=0.933。為了方便實(shí)際操作，將提取條件修正為水料比20∶1，超聲時(shí)間55 min，微波時(shí)間20 min。在此條件下多糖提取的理論值為2.26%，而實(shí)際測(cè)得的提取率為2.23%，即與理論值的誤差為1.35%，說(shuō)明實(shí)際值與理論值基本相符，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的超聲波結(jié)合微波的提取條件參數(shù)，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在低溫即盡可能的保留多糖活性的條件下，利用響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，得到最優(yōu)的提取條件為水料比20∶1，超聲時(shí)間55 min，微波時(shí)間20 min(200 W，60℃)，在此條件下靈芝糖的提取率達(dá)到了2.23%，具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值，為今后靈芝孢子多糖的工業(yè)化提取提供參考。

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Optimization of Extraction Process of Polysaccharides from Ganoderma Lucidum Spore by Response Surface Analysis

Meng Fan-bing1，Li Yun-cheng1，Zhang Shu-rong1，Zeng Xiao-man1，Zhong Geng1，2*
1(College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400716，China)
2(Engineering Technique Research Center of Chongqing for Special Food，Chongqing 400715，China)

This paper describes the optimization of extraction process of polysaccharides from Ganoderma lucidumspore by response surface analysis.The effects of three independent variables(namely，ratio of water to material，ultrasonic extraction time and microwave-assisted extraction time)on the yield of polysaccharides from Ganoderma lucidumspore were evaluated.Extraction ratio of water to material of 20:1，ultrasonic extraction time of 55 min，microwave-assisted extraction time of 20 min and were found optimum.Under these optimized conditions，the experimental value of Polysaccharides yield was 2.23%.

Ganoderma lucidum spore，response surface analysis，polysaccharides，extraction

碩士研究生(鐘耕教授為通訊作者，E-mail:zhonggdg@126.com)。

*重慶市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(CSTC，2009AC5183)

2011－07－13，改回日期:2011－10－25