張波，管政兵，謝廣發(fā)，陸健，余培斌

1(江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)2(江南大學生物工程學院，江蘇無錫，214122)3(浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，浙江 紹興，312000)

麥曲在黃酒釀造中占有極重要的地位，其質(zhì)量的優(yōu)劣，直接影響著黃酒的產(chǎn)量和質(zhì)量，因此麥曲又有“酒之骨”的美譽［1］。傳統(tǒng)的黃酒釀造采用的是自然固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的生麥曲，以小麥為原料，通過網(wǎng)羅自然界中微生物，在堆放車間中進行自然接種，使附著在小麥表面的微生物生長繁殖并代謝產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物［2－3］。制曲過程也就是在微生物的參與下，發(fā)生著一系列的生物化學變化的過程。通常整個制曲過程根據(jù)麥曲品溫的變化分為6個階段:起始期(麥曲制作成型后堆放在曲房的第1天)，發(fā)酵前期(麥曲進入曲房的第2天)，升溫期(第3天，微生物大量繁殖并開始產(chǎn)熱，麥曲品溫逐漸上升)，高溫期(第4天，麥曲品溫達到最高溫度51～55℃，耐熱性差的微生物因高溫環(huán)境而失活死亡，而一些霉菌則停止生長，產(chǎn)生孢子)，降溫期(第5～7天，及時的開窗通風措施使得麥曲品溫逐漸回落)，成熟期(培養(yǎng)至25～30天，麥曲品溫與室溫相近，麥曲中水分含量逐漸降低，微生物停止生長，麥曲已結(jié)成硬塊，即已成熟)。由于麥曲品溫和水分含量的變化，不同時期麥曲中參與發(fā)酵的微生物不同，所參與的反應以及產(chǎn)酶情況也有所不同［3－5］。

目前對黃酒麥曲制曲過程的研究，一般多是通過酶活力的測定來研究制曲過程中主要水解酶系的活力變化，而對于這些同功酶的構(gòu)成及其來源等，往往不能進行全面而有效的分析［6］。在麥曲制曲過程中微生物群落的動態(tài)變化研究方面，目前主要是利用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定結(jié)合分子生態(tài)學方法，如核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析(RISA)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)［7－9］。然而，利用這些方法所獲得的研究結(jié)果無法將麥曲中存在的特定微生物與其分泌的特定胞外酶聯(lián)系起來，從而達到深入理解黃酒麥曲固態(tài)發(fā)酵機理的目的。近幾年來迅速發(fā)展起來的宏蛋白質(zhì)組學理論和技術(shù)將可能解決這一問題。

目前主要應用于環(huán)境微生物生態(tài)系統(tǒng)研究的宏蛋白質(zhì)組學，其定義是運用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對微生物群落進行研究的一項新技術(shù)，是從微生物群落的所有蛋白質(zhì)水平上直觀揭示復雜生態(tài)系統(tǒng)中微生物的功能及其變化［10－11］。本研究利用宏蛋白質(zhì)組學的理論和方法，將麥曲樣品浸提液中所有可溶性蛋白定義為待研究的“宏蛋白質(zhì)組”，對麥曲制曲過程中的宏蛋白質(zhì)組動態(tài)變化情況進行分析，所獲得的研究結(jié)果將有助于深入理解麥曲發(fā)酵過程機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

2010年夏秋，在紹興某黃酒廠制曲車間跟蹤兩批麥曲在制曲過程中的溫度和水分含量變化，分別采集第1天(起始期)、第2天(發(fā)酵前期)、3天(升溫期)、4天(高溫期)、6天(降溫期)和30天(成熟期)的麥曲，作為制曲過程中6個典型時期樣品［12］。

1.1.2 實驗試劑

瓊脂糖、溴酚藍、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰銨(IAA)、固相 IPG 干膠條(18cm，pH3～10，非線性)、IPG緩沖液(pH3 ～10，非線性)、3-［(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基］-1-丙磺酸(CHAPS)、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)、尿素，為GE公司產(chǎn)品。IPG覆蓋液、RCDC蛋白定量試劑盒，為Bio-Rad公司產(chǎn)品。Complete蛋白酶抑制劑混合片，為Roche公司產(chǎn)品。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過硫酸銨、考馬斯亮藍G-250、考馬斯亮藍R-250，為上海生工進口分裝產(chǎn)品。甲醇、正丁醇、甘油、冰醋酸、磷酸、三氯乙酸(TCA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、丙酮、乙酸鈉、牛血清白蛋白，均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.1.3 實驗儀器

等電聚焦電泳儀Ettan IPGphor 3、Ettan DALTsix垂直電泳系統(tǒng)和ImageScanner掃描儀，均為GE公司產(chǎn)品;CR22G型高速冷凍離心機，日本日立公司;Pico＆Fresco17微量高速冷凍離心機，Thermo公司;UV-2100型紫外可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司;脫色搖床TS-1，海門市其林貝爾儀器公司。

1.1.4 溶液配制

樣品水化液:尿素4.8 g，CHAPS 0.4 g，IPG 緩沖液50 μL，加入雙蒸水至總體積為10 mL(使用前加入50 mmol/L DTT)。

平衡液 I:尿素 72.07 g，SDS 4.0 g，1.5 mol/L Tris-HCl 6.7 mL(pH 8.8)，甘油69 mL，1%溴酚藍貯存液400 μL，加入雙蒸水至200 mL，使用前每10 mL加入DTT 100 mg。

平衡液 II:尿素 72.07 g，SDS 4.0 g，1.5mol/L Tris-HCl 6.7 mL(pH 8.8)，甘油69 mL，1%溴酚藍貯存液400 μL，加入雙蒸水至200 mL，使用前每10 mL加入IAA 250 mg。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

(1)麥曲浸提液的制備:稱取25 g麥曲，加入50 mL 0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 4.2)和1片Complete蛋白酶抑制劑混合片，在4℃條件下浸提過夜。然后依次用4層紗布過濾，濾液在12 000 r/min，4℃條件下離心30 min，上清液即為麥曲浸提液。Bradford 法測定蛋白含量［13］。

(2)TCA-丙酮法沉淀蛋白:取一定量的麥曲浸提液，加入4倍體積的預冷丙酮溶液I(含20 mmol/L DTT，10%TCA)，搖勻，－20℃放置3 h 沉淀蛋白，之后4℃，12 000 r/min離心30 min。棄上清液，收集沉淀。加入2 mL預冷的丙酮溶液II(含20 mmol/L DTT)，－20℃放置 1 h，清洗沉淀，4℃，12 000 r/min離心15 min。重復清洗2次。棄上清液，收集沉淀，然后置于－20℃冰箱中，使丙酮完全揮發(fā)。

(3)沉淀溶解:將干燥好的蛋白質(zhì)沉淀加入適量的樣品水化液，室溫下充分溶解，然后于12 000 r/min離心10 min，上清液即為麥曲宏蛋白質(zhì)組樣品。RC-DC蛋白定量試劑盒測定蛋白含量。

1.2.2 雙向電泳實驗分析［14］

按照GE公司《雙向電泳操作手冊》進行水化上樣和等電聚焦。吸取350 μL麥曲樣品水化液加入到膠條再泡脹盤中，取長度為18 cm，pH 3～10非線性的IPG干膠條水平放入其中，加入少量IPG覆蓋液，水化12 h。水化過夜后的膠條轉(zhuǎn)移到Ettan IPGphor膠條槽中，進行等電聚焦。等電聚焦程序設(shè)置為:Step，50V×2 h;Gradient，150V × 2 h;Gradient，250V × 2 h;Gradient，500V × 2 h;Gradient，1 000V ×2 h;Gradient，5 000V ×2 h;Gradient，10 000V ×2 h;Step，10 000V ×40 000Vh。

等電聚焦結(jié)束后，立即進行平衡。采用兩步平衡法，先將IPG膠條放入平衡液I中，在水平搖床上平衡15 min，再使用平衡液II進行第2步平衡，在搖床上平衡15 min。

平衡后進行第二向SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為12.5%(26 cm ×21 cm ×1 mm)。將平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移到已聚合的聚丙烯酰胺凝膠膠面頂端，用0.5%的瓊脂糖封閉，排除膠條與膠面之間的氣泡。以恒功率方式進行電泳:2 W/根膠條，1.5 h，然后調(diào)至16 W/根膠條。

凝膠染色、脫色:剝離凝膠，置于固定液(50%乙醇，10%乙酸)固定1h后，換到考馬斯亮藍染色液(0.025%考馬斯亮藍R-250，25%乙醇，10%乙酸)中染色4 h，換脫色液(10%甲醇，10%乙酸)中脫色，直至背景為無色透明，蛋白點清晰為止。

1.2.3 凝膠掃描及圖譜分析［15］

完成染色的雙向電泳凝膠經(jīng)過Image ScannerIII凝膠成像系統(tǒng)掃描并保存圖像，圖像使用PDQuest軟件進行對比分析。所有圖像選擇自動找點模式，并手動校正以去除背景噪音和橫縱條紋。對不同時期的麥曲浸提液的雙向電泳圖譜進行匹配和比對分析，并對蛋白點的定量值進行標準化處理。定量差異≥2倍認定為差異蛋白點。

1.2.4 質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫搜索［16］

挖取差異蛋白點送往上海博苑生物科技公司蛋白質(zhì)組技術(shù)中心進行進行串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MS)分析，獲得的質(zhì)譜分析結(jié)果再利用Mascot在線服務器(http://www.matrixscience.com/)以美國國立生物技術(shù)信息中心GenBank的總蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(NCBInr)進行檢索。

2 結(jié)果與討論

2.1 麥曲制曲過程中水分含量和溫度的變化情況

小麥經(jīng)過碾碎、加水拌曲、壓制成型、堆曲培養(yǎng)和通風干燥之后得到成品麥曲。在麥曲的生產(chǎn)過程中，工廠主要是通過控制制曲過程的麥曲品溫來控制麥曲的質(zhì)量。制曲過程中水分、溫度的變化曲線如圖1所示。

圖1 制曲過程中水分含量和溫度的變化曲線

從圖1中可以看出，小麥經(jīng)過軋碎拌水成型后，進入曲房，及時的關(guān)窗措施和稻草覆蓋造成相對封閉的環(huán)境，隨著麥曲水分的逐步揮發(fā)以及麥曲中微生物的生理代謝開始活躍，放出大量的熱，于第4天達到麥曲中最高品溫(55℃)。在這個高溫下，一些微生物被淘汰，霉菌基本停止生長，開始產(chǎn)生孢子。此后采用開窗等降溫措施，麥曲品溫逐漸回落，在曲塊成型堆放的第1周，麥曲品溫一直維持在37℃以上。此后麥曲品溫逐漸降低，在麥曲制作結(jié)束時，品溫接近室溫。制曲過程中麥曲中的水分一直在減少，從最初的24.0%降至12.4%左右，這時麥曲中微生物已完全停止生長。黃酒麥曲在成型堆放過程中合適的水分和品溫，為麥曲中微生物的生長及代謝產(chǎn)酶提供了條件。根據(jù)制曲過程中麥曲品溫發(fā)生顯著變化時間點的情況，分別選擇固態(tài)發(fā)酵第1、2、3、4、6及30天的麥曲作為制曲過程的6個典型時期樣品，進行麥曲浸提液的宏蛋白質(zhì)組學研究。

2.2 麥曲制曲過程中不同時期浸提液的宏蛋白質(zhì)組樣品的雙向電泳圖譜分析

紹興黃酒麥曲制曲過程中6個不同時期的麥曲浸提液經(jīng)過TCA-丙酮處理后獲得宏蛋白質(zhì)組樣品，每個時期蛋白樣品的上樣量均控制在～550 μg左右，使用長度為18 cm，pH 3～10非線性的IPG膠條進行雙向電泳實驗，獲得了分辨率較高的雙向電泳圖譜(見圖2)。

圖2 紹興黃酒麥曲制曲過程中不同時期的雙向電泳圖譜

應用PDQuest軟件對制曲過程中6個不同時期的電泳圖譜進行蛋白點檢測，分別檢測到了89、102、110、105、97及100個清晰且重復度高的蛋白質(zhì)點。對以上6個時期蛋白質(zhì)點的表達豐度(根據(jù)蛋白質(zhì)點的相對體積自動生成的數(shù)量值)進行差異檢測，共找到12個差異蛋白點(見圖3及表1)，其中差異蛋白點1－7的局部放大圖見圖4。

圖3 紹興黃酒麥曲成熟期樣品的雙向電泳圖譜上差異蛋白點

圖4 麥曲制曲過程中不同時期的雙向電泳圖譜中部分差異蛋白點的放大圖

對制曲過程中差異表達量變化在2倍以上的12個差異蛋白，按照表達豐度的變化可分為3類:第1類是隨著制曲過程，蛋白質(zhì)表達量逐漸上升(蛋白點編號為5、7、9和10);第2類是制曲過程中蛋白表達量先上升后下降(蛋白點編號為1、2、3、4、6 和 8);第3類是制曲過程中蛋白表達量逐漸降低(蛋白點編號為11和12)。

表1 制曲過程中12個差異蛋白點的表達豐度值及變化曲線

2.3 差異蛋白點的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

在成熟期樣品的雙向電泳凝膠上挖取這12個差異蛋白點進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，質(zhì)譜分析所得數(shù)據(jù)通過Mascot在線軟件，對NCBI蛋白質(zhì)總庫進行檢索。共有7個蛋白點鑒定成功，鑒定結(jié)果列于表2。

表2 紹興黃酒麥曲制曲過程中不同時期差異蛋白點的MALDI-TOF/TOF MS鑒定結(jié)果

由表2可見，鑒定得到的7種蛋白中來自微生物的蛋白有4種，分別是來自地中海擬無枝菌酸菌產(chǎn)生的凝結(jié)因子5/8型功能蛋白和微單孢菌屬產(chǎn)生的蘋果酸脫氫酶，以及糖紅孢紅霉菌產(chǎn)生的葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶和羧肽酶前體蛋白。小麥來源的蛋白有2種，分別是木聚糖酶抑制蛋白I和幾丁質(zhì)酶II。此外還有一種外子藻來源的功能未知的假定蛋白。

從鑒定結(jié)果來看，麥曲中存在多種微生物參與各種生物化學反應，這也進一步證實了制曲過程是多菌種參與發(fā)酵的過程。其中糖紅孢紅霉菌分泌的葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶主要催化糖酵解中葡萄糖-6-磷酸與果糖-6-磷酸的可逆轉(zhuǎn)化。微單孢菌屬分泌的蘋果酸脫氫酶，它催化檸檬酸循環(huán)(三羧酸循環(huán))中蘋果酸與草酰乙酸之間的可逆轉(zhuǎn)換。他們都與丙酮酸、乳酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸等黃酒風味物質(zhì)的代謝有著一定的關(guān)系［17］。羧肽酶前體蛋白最終生成羧肽酶，羧肽酶是一類肽鏈端水解酶，作用于肽鏈的游離羧基末端釋放單個氨基酸，在黃酒發(fā)酵過程中與酸性蛋白酶共同作用于糯米中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生游離的氨基酸，能賦予黃酒特有的風味［18］。稀有細菌地中海擬無枝菌酸菌分泌的凝結(jié)因子5/8型功能蛋白在細胞表面識別、信號轉(zhuǎn)導過程中起著重要作用。

同時麥曲的浸提液中還存在著小麥相關(guān)的蛋白如木聚糖酶抑制蛋白和幾丁質(zhì)酶等。木聚糖酶抑制劑存在于多種谷物中，如小麥、黑麥、大麥、玉米等。谷物中的木聚糖酶抑制劑僅對微生物來源的木聚糖酶有活性，而與植物內(nèi)源性木聚糖酶不發(fā)生作用，因此它們被看作植物防御外來致病性侵害的屏障［19］小麥種子中包含3類木聚糖酶抑制劑:TAXI、XIP、TLXI。在黃酒麥曲中鑒定出的木聚糖酶抑制劑為TAXI。TAXI僅存在于小麥種子中，它對真菌和細菌木聚糖酶均具有抑制作用，但僅限于G/11家族木聚糖［20］。幾丁質(zhì)酶是一類復合酶，主要水解幾丁質(zhì)多聚體中的β-1，4-糖苷鍵，產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖寡聚體，許多微生物、動物、植物等都可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。高等植物的細胞中本身不含幾丁質(zhì)，但當植物受到真菌、細菌或病毒等的感染時，幾丁質(zhì)酶的活性迅速提高。植物產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶大部分為第19族糖基化水解酶類，其功能主要是抑制病原微生物的生長，進行自我防御，是重要的病程相關(guān)蛋白［21－22］。木聚糖酶抑制劑和幾丁質(zhì)酶在麥曲固態(tài)發(fā)酵和黃酒發(fā)酵發(fā)酵過程中的具體作用，目前還未見相關(guān)報道。

以小麥為原料，采用天然的固態(tài)發(fā)酵方式生產(chǎn)麥曲是黃酒釀造中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，麥曲質(zhì)量的好壞對于黃酒的釀造具有舉足輕重的作用，但目前對于麥曲在固態(tài)發(fā)酵過程中許多機理性問題尚不清楚。本研究中首次借助宏蛋白質(zhì)組學的理論和方法對紹興黃酒麥曲制曲過程中不同時期的麥曲浸提液進行了宏蛋白質(zhì)組學研究，包括通過雙向電泳分離宏蛋白質(zhì)組樣品、利用PDQuest軟件分析不同時期樣品的差異蛋白點以及對差異蛋白點進行質(zhì)譜分析鑒定，所獲得的研究結(jié)果將有助于理解麥曲固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)過程的機理。

［1］ 顧國賢.釀造酒工藝學(第2版)［M］．北京:中國輕工業(yè)出版杜，2007:471－483.

［2］ 汪建國.小麥制曲在傳統(tǒng)黃酒釀造中的工藝探討［J］．中國釀造，2003(5):20－22.

［3］ 汪建國.傳統(tǒng)麥曲在黃酒釀造中的作用和特色［J］．中國釀造，2004(10):29－31.

［4］ 謝廣發(fā).黃酒釀造技術(shù)［M］．北京:中國輕工業(yè)出版杜，2010:42－59.

［5］ 傅祖康，楊國軍.黃酒生產(chǎn)200問［M］．北京:化學工業(yè)出版社，2010:49－55.

［6］ 王璐.黃酒麥曲中淀粉酶的分離純化及其性質(zhì)研究［D］．無錫:江南大學，2007.

［7］ 方華.紹興黃酒麥曲中真菌資源的初步研究［D］．無錫:江南大學，2006.

［8］ 李旺軍.紹興黃酒麥曲中微生物的初步研究［D］．無錫:江南大學，2007.

［9］ 陳建堯.紹興黃酒麥曲品質(zhì)及其影響因素的研究［D］．無錫:江南大學，2008.

［10］ Wilmes P，Bond PL.Metaproteomics:studying functional gene expression in microbial ecosystems［J］．Trends Microbiol，2006，14(2):92 －97.

［11］ Maron PA，Ranjard L，Mougel C，et al.Metaproteomics:a new approach for studying functional microbial ecology［J］．Microb Ecol，2007，53(3):486 －493.

［12］ 趙光鰲.黃酒生產(chǎn)分析檢驗［M］．北京:輕工業(yè)出版社，1987:27－38.

［13］ Oda K，Kakizono D，Yamada O，et al.Proteomic analysis of extracellular proteins from Aspergillus oryzae grown under submerged and solid-state culture conditions［J］．Appl Environ Microbiol，2006，72(5):3 448 －3 457.

［14］ Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］．Anal Biochem，1976(72):248－254.

［14］ R J辛普森.蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組學實驗指南［M］．北京:化學工業(yè)出版社，2006:131－174.

［15］ 陳捷.農(nóng)業(yè)生物蛋白質(zhì)組學［M］．北京:科學出版社，2009:104－123.

［16］ 薛慶中.DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)分析工具［M］．北京:科學出版社，2009:117－129.

［17］ 壽虹志，凌志勇，楊旭，等.淺析黃酒麥曲中微生物與黃酒風味的關(guān)系［J］．中國釀造，2007(8):55－57.

［18］ 汪建國.黃酒中色、香、味、體的構(gòu)成和來源淺析［J］．中國釀造，2004(4):6－10.

［19］ Evi C，Kurt G，Johan R，et al.Variability of polymorphic families of three types of xylanase inhibitors in the wheat grain proteome ［J］．Proteomics，2008，8(8):1 692－1 705.

［20］ Evi C，Kurt G，Nikkie L，et al.The three classes of wheat xylanase-inhibiting proteins accumulate in an analogous way during wheat ear development and germination［J］．Journal of Plant Physiology，2009，166(12):1 253－1 262.

［21］ 熊國如，楊本鵬，王俊剛，等.植物幾丁質(zhì)酶研究進展［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38(22):11 685－11 688.

［22］ 張志忠，吳菁華，呂柳新.植物幾丁質(zhì)酶及其應用研究進展［J］．福建農(nóng)林大學學報:自然科學版，2005，34(4):294－299.