王小元

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)纈氨酸的代謝工程研究進(jìn)展

王小元

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

L－纈氨酸是人體必需的三種支鏈氨基酸之一，在生命代謝過程中起著非常重要的作用，因此被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及飼料等行業(yè)。目前，L－纈氨酸主要采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，而谷氨酸棒桿菌是最常用的生產(chǎn)菌種。作者分析了谷氨酸棒桿菌中L－纈氨酸的生物合成途徑和代謝調(diào)控，綜述了對其進(jìn)行代謝工程改造來提高L－纈氨酸產(chǎn)量的最新研究進(jìn)展。

谷氨酸棒桿菌；L－纈氨酸生產(chǎn)；代謝工程；發(fā)酵；支鏈氨基酸

自從1957年Kinoshita等人［1］報(bào)道了谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum）可以發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸，該菌已逐漸被用來發(fā)酵生產(chǎn)各種氨基酸，包括L－纈氨酸（L－valine）。L－纈氨酸是人體必需的一種支鏈氨基酸，具有多種生理功能，因此被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及飼料等行業(yè)。例如，L－纈氨酸在食品工業(yè)中用作營養(yǎng)強(qiáng)化劑和增香劑，在醫(yī)藥工業(yè)中用于制造復(fù)合氨基酸注射液和合成抗生素，在飼料行業(yè)中作為一種限制性氨基酸添加劑。由于其用途廣泛，市場上L－纈氨酸總是處于供不應(yīng)求局面，帶動企業(yè)在L－纈氨酸產(chǎn)量及其生產(chǎn)成本等方面的良性競爭。目前，多數(shù)企業(yè)使用的L－纈氨酸生產(chǎn)菌來自于反復(fù)誘變，因而其遺傳背景不明，很難通過進(jìn)一步誘變來提高L－纈氨酸產(chǎn)量。近年來，隨著谷氨酸棒桿菌全基因組測序及基因功能注釋的完成［2］，代謝工程已被于構(gòu)建L－纈氨酸生產(chǎn)菌，成為提高L－纈氨酸發(fā)酵生產(chǎn)水平的最有效方法。眾所周知，優(yōu)良的生產(chǎn)菌種是提高發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的保障。作者在分析谷氨酸棒桿菌中L－纈氨酸的生物合成途徑和代謝調(diào)控機(jī)理的基礎(chǔ)上，對其生產(chǎn)L－纈氨酸的代謝工程改造的研究進(jìn)行綜述。

1 谷氨酸棒桿菌中L－纈氨酸分子的生物合成途徑

谷氨酸棒桿菌中L－纈氨酸的合成途徑見圖1。從丙酮酸出發(fā)，L－纈氨酸的合成先后涉及到乙酰羥酸合酶（AHAS）、乙酰羥酸同分異構(gòu)酶（AHAIR）、二羥酸脫水酶（DHAD）和支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（TA）等［3－5］。首先，由兩個(gè)基因ilv B和ilv N共同編碼的AHAS將兩分子的丙酮酸縮合成2－乙酰乳酸；其次，由基因ilvC編碼的AHAIR將2－乙酰乳酸轉(zhuǎn)化成雙羥基異戊酸；再次，由基因ilv D編碼的DHAD將雙羥基異戊酸脫水形成2－酮異戊酸；最后，由基因ilv E編碼的TA將2－酮異戊酸轉(zhuǎn)化成L－纈氨酸；由pd x R和avt A編碼的蛋白質(zhì)在L－纈氨酸合成的最后一步也起到轉(zhuǎn)氨酶的作用［6］。另外，TA也能催化L－亮氨酸和L－異亮氨酸合成途徑的最后一步反應(yīng)［5］。

谷氨酸棒桿菌中L－纈氨酸的合成途徑還與其它一些主要代謝產(chǎn)物的合成途徑相互交錯(cuò)，見圖1。首先，L－纈氨酸合成的關(guān)鍵前體物質(zhì)丙酮酸（Pyruvate）同時(shí)也被用于合成L－丙氨酸（L－alanine）、乙酰Co A（Acetyl Co A）和草酰乙酸（Oxaloacetate）。其次，L－纈氨酸的合成與L－異亮氨酸（L－isoleucine）的合成共享AHAS、AHAIR、DHAD和TA等4種酶，但是這些酶在不同的合成途徑選用不同的底物。例如，AHAS以丙酮酸為底物合成L－纈氨酸，而用丙酮酸和2－酮丁酸二者為底物則合成L－異亮氨酸。AHAS對2－酮丁酸的親和性遠(yuǎn)高于丙酮酸，因此在有2－酮丁酸存在時(shí)，丙酮酸被用來優(yōu)先合成L－異亮氨酸，不利于 L－纈氨酸的積累［7］。最后，L－纈氨酸合成前體2－酮異戊酸的同時(shí)也被用于合成L－亮氨酸（L－leucine）和 D－泛酸（D－pantothenate）。針對這些特點(diǎn)，在優(yōu)化谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)L－纈氨酸時(shí)，不僅要加強(qiáng)L－纈氨酸的合成，還要考慮減弱其它相關(guān)代謝產(chǎn)物的合成，積累關(guān)鍵前體物質(zhì)，將碳流導(dǎo)向L－纈氨酸的合成。

2 谷氨酸棒桿菌中L－纈氨酸合成相關(guān)的調(diào)控機(jī)制

微生物細(xì)胞內(nèi)存在復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)，許多分子的合成都在DNA或蛋白質(zhì)層次上受到嚴(yán)格調(diào)控，L－纈氨酸也不例外。L－纈氨酸合成途徑中的一些關(guān)鍵酶受到產(chǎn)物抑制或轉(zhuǎn)錄弱化作用調(diào)控。胞內(nèi)合成的L－纈氨酸的胞外分泌也受到調(diào)控。因此，要對L－纈氨酸生產(chǎn)菌進(jìn)行理性的代謝工程優(yōu)化，必須對其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行全面了解。

2.1 氨基酸產(chǎn)物對乙酰羥酸合酶的反饋抑制

L－纈氨酸反饋抑制的主要對象是其合成途徑上的第一個(gè)關(guān)鍵酶AHAS。谷氨酸棒桿菌中AHAS全酶是四聚體，由兩個(gè)相同的大亞基和兩個(gè)相同的小亞基構(gòu)成。大亞基為催化亞基，由ilv B基因編碼；而小亞基為調(diào)節(jié)亞基，由ilv N基因編碼。3種支鏈氨基酸均可以反饋抑制AHAS的小亞基［7－8］。L－纈 氨 酸、L－異 亮 氨 酸 和 L－亮 氨 酸 對AHAS的 半 抑 制 濃 度 分 別 為 0.9、3.1 和 6.0 mmol／L［3］。當(dāng)濃度取5.0 mmol／L時(shí)，無論是單一的支鏈氨基酸，還是任意兩種或三種支鏈氨基酸組合，對AHAS活性的抑制程度均不會超過57%［8］。這些數(shù)據(jù)說明3種支鏈氨基酸在AHAS小亞基上的結(jié)合位點(diǎn)是相同的，但它們與該結(jié)合位點(diǎn)的親和性有差異。通過定點(diǎn)突變，對谷氨酸棒桿菌AHAS小亞基上20、21和22位的氨基酸進(jìn)行替換，可獲得一個(gè)不受任何支鏈氨基酸反饋抑制的突變體［8］。

2.2 編碼乙酰羥酸合酶的基因轉(zhuǎn)錄弱化

在谷氨酸棒狀桿菌染色體上，基因ilv B、ilv N和ilv C串聯(lián)構(gòu)成一個(gè)操縱元ilv BNC。Northern印跡實(shí)驗(yàn)證明ilv BNC操縱元可以轉(zhuǎn)錄3種長度分別為3.9、2.3、1.1 kb的 m RNA；它們分別對應(yīng)于ilv BNC、ilv NC和ilvC3種DNA 片段［4］。如果將ilv B的上游序列刪除，則只能獲得長度分別為2.3 kb和1.1 kb的m RNA；如果將ilv N的上游序列刪除，則只能獲得長度為1.1 kb的 mRNA［4］。這些數(shù)據(jù)說明ilv BNC操縱子中含有3個(gè)啟動子，因而基因ilvC可被轉(zhuǎn)錄3次，導(dǎo)致其表達(dá)效率在3個(gè)基因中最高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在ilv B上游292 bp處的一段DNA能表達(dá)一個(gè)短肽。這個(gè)短肽含有25個(gè)氨基酸，其中包括2個(gè)L－異亮氨酸、3個(gè)L－纈氨酸和2個(gè)L－亮氨酸，且短肽形成序列的后面存在能形成RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄終止子結(jié)構(gòu)的序列［9］，說明這個(gè)短肽是對操縱元ilv BNC具有弱化調(diào)節(jié)作用的前導(dǎo)肽。前導(dǎo)肽翻譯偶聯(lián)的弱化作用對il－v BNC的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)一步被Mobach等人用lacZ作為報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)［9］。

圖1 谷氨酸棒桿菌中L－纈氨酸的生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis of L－valine in C.glutamicum

2.3 L－纈氨酸胞外分泌的調(diào)控

如果胞內(nèi)的L－纈氨酸不能被及時(shí)分泌到胞外，積累的L－纈氨酸就會抑制其生物合成途徑中關(guān)鍵酶的活性，并弱化編碼關(guān)鍵酶的基因轉(zhuǎn)錄，使L－纈氨酸的合成速度降低。胞內(nèi)的L－纈氨酸必須通過膜轉(zhuǎn)運(yùn)酶Brn F和Brn E分泌到胞外［10］。全局基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，L－異亮氨酸的加入可以增加野生型谷氨酸棒桿菌中BrnF和BrnE的表達(dá)，但是對lrp敲除菌株沒有影響。通過與lrp和brn F的啟動子的轉(zhuǎn)錄融合表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加3種支鏈氨基酸或L－甲硫氨酸均可以刺激brn FE的表達(dá)，但是這種刺激作用需要調(diào)控因子Lrp的存在［11］。芯片分析、帶轉(zhuǎn)變實(shí)驗(yàn)和DNAse足跡分析證明Lrp結(jié)合在lrp和brn F之間的DNA上［11］。

3 L－纈氨酸代謝工程菌研究進(jìn)展

L－纈氨酸工業(yè)生產(chǎn)菌主要來自于傳統(tǒng)誘變育種［12］，但目前代謝工程正在被用于谷氨酸棒桿菌的改良：利用已知的遺傳學(xué)信息，對L－纈氨酸代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行系統(tǒng)分析，并采用基因工程技術(shù)改造谷氨酸棒桿菌以提高L－纈氨酸的產(chǎn)量［13－14］。近年來，一些適用于用于谷氨酸棒桿菌的表達(dá)載體已經(jīng)被構(gòu)建［15－17］。這些表達(dá)載體一般為大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌的穿梭載體，含有較多的限制酶單酶切位點(diǎn)，有的是誘導(dǎo)性表達(dá)，有的是組成型表達(dá)。在谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行基因敲除的各種方法已經(jīng)被建立［18－19］。由于同一啟動子在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中的活性差別很大，所以針對谷氨酸棒桿菌中啟動子的研究也已經(jīng)展開［20－21］。目前，人們已經(jīng)從阻止雜酸合成、積累關(guān)鍵前體物質(zhì)、解除反饋抑制和優(yōu)化啟動子等方面入手構(gòu)建出一些能高產(chǎn)L－纈氨酸的代謝工程菌，見圖2。通過解析影響L－纈氨酸合成的關(guān)鍵因素，對谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組進(jìn)行優(yōu)化或在其中高效表達(dá)關(guān)鍵基因均可以大幅度地提高 L－纈氨酸的產(chǎn)量［8，15，22－24］。

圖2 谷氨酸棒桿菌L－纈氨酸生產(chǎn)菌的代謝工程優(yōu)化Fig.2 Metabolic engineering of L－valine production strains

3.1 切斷旁支路并加強(qiáng)主干道碳流

如圖1所示，L－纈氨酸的合成與L－異亮氨酸、L－亮氨酸和D－泛酸的合成交錯(cuò)在一起。因此，要提高L－纈氨酸的產(chǎn)量，首先要通過基因敲除阻止雜酸合成，然后通過高效表達(dá)來進(jìn)一步加強(qiáng)L－纈氨酸合成。L－異亮氨酸和L－纈氨酸的合成途徑共享的4個(gè)酶需要不同的底物。合成L－異亮氨酸最關(guān)鍵的前體是L－蘇氨酸在ilv A編碼的蘇氨酸脫氨酶作用下產(chǎn)生的2－酮丁酸，所以可以通過敲除基因ilv A阻止L－異亮氨酸的合成。2－酮異戊酸是L－纈氨酸、L－亮氨酸和D－泛酸等3種酸的共同合成前體。由leu A編碼的異丙基蘋果酸合酶是L－亮氨酸合成途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，通過敲除基因leu A可以阻止L－亮氨酸的合成。從2－酮異戊酸到泛酸的合成涉及到3個(gè)基因pan B、panC和pan E，其中兩個(gè)關(guān)鍵基因panB和panC在染色體上位置相鄰，通過敲除這兩個(gè)基因可以阻止D－泛酸的合成。從丙酮酸出發(fā)合成L－纈氨酸需要5個(gè)基因ilv B、ilv N、ilv C、ilv D和ilv E。在基因組中，ilv B、ilv N和ilvC3個(gè)基因是串聯(lián)的，ilv D與ilv B只相隔兩個(gè)基因，而ilv E卻遠(yuǎn)離其他基因。所以，基因ilv BNCD可以作為一個(gè)整體從基因組中擴(kuò)增出來，通過載體高效表達(dá)來提高L－纈氨酸的產(chǎn)率。2002年，Radmacher等人通過缺失ilv A和pan BC基因并過量表達(dá)il－v BNCD基因構(gòu)建了一個(gè)谷氨酸棒桿菌L－纈氨酸高產(chǎn) 工 程 菌 株 ATCC 13032Δilv AΔpan BCpJC1ilv BNCD［15］。該菌株利用4 g／d L葡萄糖搖瓶培養(yǎng)48 h能產(chǎn)生91.9 mmol／L（10.8 g／L）的L－纈氨酸。

3.2 積累關(guān)鍵前體和儲備能源

L－纈氨酸合成的關(guān)鍵前體丙酮酸是細(xì)胞內(nèi)非常重要的代謝產(chǎn)物，因此，降低丙酮酸的消耗也可以增加L－纈氨酸產(chǎn)量。谷氨酸棒桿菌中丙酮酸的消耗方式主要有下列幾種：一是通過ala T和avt A等基因編碼的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AA）生成L－丙氨酸［25］；二是通過aceE等基因編碼的丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（PDHC）直接合成乙酰－CoA，或通過pqo基因編碼的丙酮酸／奎寧氧化還原酶合成乙酸，再進(jìn)一步合成乙酰－CoA；三是通過丙氨酸羧化酶（PC）合成草酰乙酸。敲除這些相關(guān)基因，就可以通過積累丙酮酸而增加L－纈氨酸產(chǎn)量或通過減少雜酸含量而降低其生產(chǎn)成本。比如，在谷氨酸棒桿菌ATCC 13032ΔilvAΔpanBCpJC1ilvBNCD［15］中進(jìn)一步敲除alaT基因，L－纈氨酸的產(chǎn)量雖然增加不明顯，但雜酸L－丙氨酸的含量降低了80%，最終導(dǎo)致下游分離純化成本的降低［25］。通過敲除aceE基因并過表達(dá)ilv BNCE而構(gòu)建的ATCC13032ΔaceEpJC4ilv BNCE分批發(fā)酵能產(chǎn)生210 mmol／L（24.6 g／L）的 L－纈氨酸［22］，說明丙酮酸的累積確實(shí)能增加L－纈氨酸產(chǎn)量。進(jìn)一步敲除pqo基 因，得 到 的 菌 株 ATCC13032ΔaceEΔpqopJC4ilv BNCE能進(jìn)一步提高L－纈氨酸的產(chǎn)量。由于培養(yǎng)丙酮酸脫氫酶缺陷型谷氨酸棒桿菌必須添加乙酸，這會影響葡萄糖的消耗，進(jìn)而影響L－纈氨酸的合成［26］。Blombach等人［23］通過一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用乙醇代替乙酸可以解決這個(gè)問題。添加乙醇 來 分 批 發(fā) 酵 ATCC13032ΔaceEΔpqopJC4ilv BNCE，葡萄糖的消耗速率是乙酸的6倍，66 h后積累了301 mmol／L （35.3 g／L）的 L－纈氨酸［23］。通過降低谷氨酸棒桿菌中H＋－ATPase的活性也可以積累丙酮酸［24］。將ATCC13032中染色體上atpG基因817位的T突變成C，導(dǎo)致其編碼的H＋－ATPase的273位的Ser變成Pro，得到突變株A－1。在A－1中導(dǎo)入質(zhì)粒p VKilv N53C搖瓶發(fā)酵72 h能產(chǎn)生95.7 mmol／L（11.2 g／L）的L－纈氨酸［24］。質(zhì)粒p VKilv N53C含有ilv N53和il－vC兩個(gè)基因，其中基因ilv N53編碼的AHAS小亞基在C－端缺少53個(gè)氨基酸，導(dǎo)致AHAS具有抗L－纈氨酸反饋抑制的能力。

輔因子也會對L－纈氨酸的合成造成影響。在L－纈氨酸的合成途徑中，消耗1 mol的葡萄糖，能產(chǎn)生2 mol NADH，同時(shí)消耗2 mol NADPH，才能合成1 mol L－纈氨酸。為了消除這種輔因子的影響，可以敲除編碼磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的基因pgi，增加通過磷酸戊糖途徑的碳流而生成更多的NADPH［27］。 這 樣 獲 得 的 菌 株的ATCC13032ΔaceEΔpqoΔpgipJC4ilv BNCE分 批 發(fā) 酵 能 產(chǎn) 生412 mmol／L（48.3 g／L）的L－纈氨酸［28］。最近，Hasegawa等人通過修飾AHAIR和取代TA的方式，將對輔因子NADPH的需求轉(zhuǎn)變成對NADH的需求，也大幅度提高了L－纈氨酸的產(chǎn)量［29］。

3.3 解除反饋抑制和優(yōu)化啟動子活性

Elisakova等人［8］通過定點(diǎn)突變技術(shù)將染色體上ilv N基因編碼的AHAS的小亞基的第20～22位氨基酸由原來的GlyIleIle突變?yōu)锳sp AspPhe，導(dǎo)致AHAS完全解除了3種支鏈氨基酸的反饋抑制，在此基礎(chǔ)上敲除了ilv A和pan B基因，并轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒p ECKAilv BNC，構(gòu)建的工程菌株ilv NM13Δilv AΔpanBpECKAilv BNC能產(chǎn)生130 mmol／L（15.2 g／L）的 L－纈氨酸。以ilv NM13菌株為背景，利用染色體定點(diǎn)突變技術(shù)，Holakto等人［30］首先通過減弱ilv A和leu A基因的啟動子活性，導(dǎo)致L－異亮氨酸和L－亮氨酸的合成速率下降，其次增強(qiáng)ilvD和ilvE基因的啟動子活性，所得菌株ilv NM13ΔpanBP－ilv AM1CGP－ilv DM7P－ilv EM6在48 h內(nèi)搖瓶發(fā)酵能產(chǎn)生136 mmol／L （15.9 g／L）的L－纈氨酸。這些數(shù)據(jù)說明通過谷氨酸棒桿菌染色體上的定點(diǎn)突變來提高L－纈氨酸的產(chǎn)量也是可行的。

4 展 望

理性設(shè)計(jì)是代謝工程育種策略的最大優(yōu)勢，這樣構(gòu)建的谷氨酸棒桿菌不僅能夠最大限度地積累L－纈氨酸，而且能夠最大限度的減少雜酸，簡化后續(xù)分離提純工藝，降低生產(chǎn)成本。目前，谷氨酸棒桿菌L－纈氨酸生產(chǎn)菌的理性設(shè)計(jì)研究主要圍繞L－纈氨酸的生物合成途徑，從以下幾個(gè)方面展開：首先，在DNA層次上進(jìn)行其編碼基因的序列分析，通過定點(diǎn)突變消除轉(zhuǎn)錄弱化的調(diào)控和改變啟動子的活性；其次，在蛋白質(zhì)層次上解析這些酶的催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，通過理性改造提高其催化活性和抗反饋抑制能力；最后，通過高效表達(dá)其編碼基因?qū)⑻剂髯畲笙薅鹊貙?dǎo)向L－纈氨酸的合成。

L－纈氨酸的生物合成途徑固然是優(yōu)化改進(jìn)谷氨酸棒桿菌的關(guān)鍵，但并不是全部。要構(gòu)建最優(yōu)的谷氨酸棒桿菌L－纈氨酸生產(chǎn)菌，還有很多其它的因素要考慮。未來代謝工程研究應(yīng)針對谷氨酸棒桿菌細(xì)胞的整體代謝網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)和計(jì)算機(jī)建模等現(xiàn)代生物技術(shù)［31］，全面分析影響L－纈氨酸生產(chǎn)的所有節(jié)點(diǎn)，提出全局性的菌種改進(jìn)優(yōu)化策略。

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Metabolic Engineering inCorynebacteriumglutamicumto Increase L－Valine Production

WANGXiao－yuan

（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

L－valine，one of the three branched－chain amino acids，is essential for human，and plays an important role in the metabolism of life，therefore，it is widely used in products of food，medicine and feed.L－valine is mainly produced by bacterial fermentation，and the most used bacterium is Corynebacterium glutamicum.In this article，the pathway and regulation of L－valine biosynthesis in C.glutamicum are analyzed and researches on metabolic engineering to increase L－valine production in C.glutamicum are reviewed.

Corynebacteriumglutamicum，L－valine production，metabolic engineering，fermentation，branched－chain amino acids

Q 933

A

1673－1689（2012）03－0225－07

2012－02－20

王小元（1965－），男，山西垣曲人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事工業(yè)微生物代謝工程方面的研究。E－mail：xiaoyuanwang＠hotmail.com