張雨薇， 楊雪鵬， 魏東芝， 艾志錄

（1.河南農業(yè)大學 食品科學技術學院，河南 鄭州 450002；2.鄭州輕工業(yè)學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002）

生物電化學法轉化甘油生產1，3－二羥基丙酮

張雨薇1，2， 楊雪鵬2， 魏東芝2， 艾志錄＊1

（1.河南農業(yè)大學 食品科學技術學院，河南 鄭州 450002；2.鄭州輕工業(yè)學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002）

氧化葡萄糖酸桿菌中依賴輔基吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline Quinone，PQQ）的膜結合甘油脫氫酶（Glycerol dehydrogenase，GDH）是酶法轉化甘油生成 1，3－二羥基丙酮（1，3－Dihydroxyacetone，DHA）的關鍵酶。以鐵氰化鉀為電子媒介體，采用生物電化學法，再生甘油脫氫酶的輔基PQQ，從而實現酶法循環(huán)轉化甘油生產DHA。設計電耦聯反應裝置，在（28±2）℃，370 m V電壓下反應18 h，DHA質量濃度達到27.21 g／L，甘油轉化率為52.93%。

1－3二羥丙酮；甘油脫氫酶；生物電化學法；氧化葡萄糖酸桿菌

二羥基丙酮或1，3－二羥基丙酮，英文名為1，3－dihydroxyacetone 或 dihydroxyactone， 簡 寫 為DHA［1］，是一種重要的醫(yī)藥中間體和功能添加劑，在國外已得到廣泛應用。作為生產DHA的原料——甘油隨著近年來生物柴油的迅速發(fā)展而大量產生。因此，生物法轉化甘油生產DHA的研究對于延伸石化產品生產鏈，創(chuàng)造更好的經濟和社會效益，提升行業(yè)競爭力具有積極作用。

生物法生產DHA可以分為微生物法和酶法兩種。其中酶法生產過程中需要大量輔酶，而輔酶價格昂貴，因此在酶法生產中有必要對輔酶進行循環(huán)再生。目前，報道的輔酶再生的方法主要集中在雙酶耦聯反應［2－3］。

作者針對氧化葡糖酸桿菌膜結合甘油脫氫酶（GDH）（EC1.1.99.22）［4］，設計生物電化學法再生甘油脫氫酶輔基PQQ，從而實現甘油到二羥基丙酮的持續(xù)轉化，進而提高產品得率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxy dans）：作者所在實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基：8 g／d L 山梨醇，2 g／d L酵母粉，1 g／d L 氯化鈉，2 g／d L 瓊脂，自然p H。

種子培養(yǎng)、基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：8 g／d L山梨醇，2 g／d L酵母粉，1 g／d L氯化鈉，自然p H。

1.1.3 主要試劑二羥丙酮顯色液：二苯胺4.8 g，濃硫酸48 m L，冰醋酸432 m L，混勻，避光保藏；吩嗪 硫 酸 甲 酯 （PMS）、2，6－二 氯 酚 吲 哚 酚 納（DCIP）：美國Sigma公司；酵母粉：Oxoid公司；D－山梨醇：北京Solarbio公司；甘油、鐵氰化鉀等試劑均為分析純。

1.1.4 主要儀器UV2300紫外可見分光光度儀：上海光譜儀器有限公司；HZQ－F160全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海?，攲嶒炘O備有限公司；Cs350電化學工作站：武漢科思特儀器有限公司；DS65A高速冷凍離心機：美國Beckman公司；ZF－3恒電位儀：上海正方電子電器有限公司；甘油含量測定試劑盒：北京五洲原業(yè)科貿公司。

1.2 方法

1.2.1 氧化葡萄糖酸桿菌的培養(yǎng)將保藏斜面菌種轉接斜面培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)周期2～3 d。挑取一環(huán)斜面菌種，接種于裝有50 m L種子培養(yǎng)基的150 m L搖瓶中，28℃、200 r／min搖床培養(yǎng)24 h。

按體積分數10%接種量將種子培養(yǎng)液接入1 L發(fā)酵培養(yǎng)基中，200 r／min、28℃培養(yǎng)至對數后期（約36 h）。

1.2.2 細胞膜組分的制備離心收集菌體，收集的菌體用蒸餾水洗滌兩次后重懸于50 mmol／L醋酸鈉（p H 5.0）緩沖液中，通過勻漿機破碎細胞，利用超速離心機100 000g離心60 min，上清液為細胞質組分，沉淀為細胞膜組分，用相同的緩沖液懸?。?－6］。

1.2.3 膜結合甘油脫氫酶的制備將膜組分重新重懸于含體積分數1%Triton X－100的40 mmol／L、p H 5.0的醋酸鈉緩沖液中，于4℃緩慢攪伴60 min。1 000 r／min離心30 min去沉淀，上清液作為待純化的樣品。

經過CM－Cellulose（1×10）柱和Sephacryl HR 400（1×120）凝膠層析柱得到分離純化的氧化葡萄糖酸桿菌膜結合甘油脫氫酶［7－8］。

1.2.4 甘油脫氫酶活性測定以PMS為電子受體，在催化反應過程中檢測600 nm吸收值的變化。酶活力測定的反應體系組成為：0.325 mmol／L PMS 0.45 m L、0.25 mmol／L DCIP 0.45 m L、100 mmol／L pH 6.0磷酸緩沖液3 m L和水4.5 m L，即配即用。首先向比色皿里加入基本反應液0.4 m L、200 mmol／L甘油0.1 m L置于1 cm的比色皿中，30℃ 預熱5 min，600 nm下吸收值平衡，然后加入酶液10μL立即進行時間掃描。在p H 6.0下DCIP的消光系數為10.8 L／mmol，一個酶活力單位（U）定義為1分鐘還原1μmol的DCIP的酶量。

1.2.5 蛋白質質量濃度的測定采用Lowry法［9］測定蛋白質質量濃度，以牛血清白蛋白作為標準品。稱取牛血清白蛋白10 mg，用0.15 mol／L NaCl溶液溶解，并定容至10 mL，最終質量濃度為1 mg／mL。

1.2.6 線性循環(huán)伏安曲線線性循環(huán)伏安曲線的測定在Cs350電化學分析系統(tǒng)上進行，鉑盤電極為工作電極，鉑絲電極為對電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極。所有實驗均在（28±2）℃、含0.5 mmol／L K3［Fe（CN）6］，0.1 mol／L KNO3，60 g／L甘油的電解液中進行。掃描速率為16 m V／s，掃描范圍為－200～＋500 m V。

1.2.7 生物電化學耦聯反應生物電化學反應的裝置見圖1。鉑盤電極為工作電極，鉑電極為對電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，向反應容器中加入55 m L反應液，加入5 m L（約5 U）純化后的甘油脫氫酶酶液通電后反應開始，電壓為370 m V，反應18 h。所有反應均在在（28±2）℃進行。每隔2 h取1 m L反應液，測定反應液中甘油和二羥丙酮的含量。

圖1 生物電化學反應裝置示意圖Fig.1 Experimental setup of bio－electrochemical preparation of 1，3－Dihydroxyacetone using GDH

1.2.8 DHA定量分析方法將反應液離心（5 000 r／min，10 min），取0.5 m L上清液稀釋至5 m L，取0.5 m L十倍稀釋液與4.5 m L顯色液在試管中混勻，置于沸水浴中反應15 min，流動水冷卻15 min后于分光光度計測量620 nm處的吸光值。這一方法可在甘油存在下，定量檢測出發(fā)酵液中質量濃度為0～3.5 mg／m L的DHA［10］。

1.2.9 甘油定量分析方法使用甘油含量測定試劑盒（北京五洲原業(yè)科貿公司）測定反應液中甘油殘余量。

2 結果與分析

2.1 膜結合甘油脫氫酶的制備

氧化葡萄糖酸桿菌膜結合甘油脫氫酶的制備主要經過3個步驟：1）細胞膜組分的分離；2）表面活性劑溶解膜蛋白；3）CM－纖維素柱和Sephacryl HR 400（1×120）凝膠柱層析。氧化葡萄糖酸桿菌中膜結合甘油脫氫酶的蛋白質分離純化過程見表1。

表1 膜結合蛋白的純化總表Tab.1 Purification of membrane－bound glycerol dehydrogenase from G.oxydans

氧化葡萄糖酸桿菌中存在著兩種形式的甘油脫氫酶，其中膜結合脫氫酶（EC1.1.99.22）代謝途徑是不需要ATP和輔酶因子NAD＋，甘油可被細胞膜上的甘油脫氫酶一步直接氧化成DHA，這一過程的電子傳遞鏈由泛醌、細胞色素O和細胞色素O還原性酶組成［11］。因此通過分離純化的膜結合甘油脫氫酶無法連續(xù)利用甘油催化生成DHA。

2.2 循環(huán)伏安曲線

分別向含有0.5 mmol／L K3［Fe（CN）6］，0.1 mol／L KNO3，60 g／L甘油的電解液中添加2、4、6、8 U的甘油脫氫酶，得到的循環(huán)伏安曲線見圖2。隨著甘油脫氫酶濃度的增加，還原電流響應降低。

隨著甘油脫氫酶的加入，一部分［Fe（CN）6］3－與PQQH2反應，見圖3。電極表面的［Fe（CN）6］3－濃度降低，還原電流相應降低。反應方程式為：

圖2 不同GDH濃度下鐵氰化鉀循環(huán)伏安曲線Fig.2 Cyclic Voltammogram of K3［Fe（CN）6］in the presence of GDH

通過循環(huán)伏安曲線，可以確定生物電化學法可以催化甘油脫氫酶輔基PQQ的再生，使膜結合甘油脫氫酶可以在只有電子媒介體存在而不添加任何輔酶的情況下連續(xù)催化甘油生成二羥基丙酮。

圖3 生物電化學法催化甘油生成二羥基丙酮原理Fig.3 Bio－electrochemical preparation of DHA from glycerol using GDH

2.3 生物電化學反應

在生物電化學反應裝置中加入含有10 mmol／L K3［Fe（CN）6］，60 g／L甘油的電化學反應液55 m L，加入5 m L（約5 U）純化后的甘油脫氫酶，在（28±2）℃，370 m V電壓下反應18 h。甘油脫氫酶催化甘油生成DHA反應曲線見圖4。

圖4 生物電化學法生產DHA曲線Fig.4 Time courses of bio－electrochemical conversion of DHA using GDH

由圖4可見，在電化學的作用下，膜結合甘油脫氫酶可以持續(xù)催化甘油生成DHA，反應18 h后，DHA質量濃度達27.21 g／L，甘油轉化率達到52.93%，電耦聯反應速率1.51 g／（L·h）。

3 結 語

通過實驗證明，生物電化學法可以持續(xù)利用氧化葡萄糖酸桿菌膜結合甘油脫氫酶制備1，3－二羥基丙酮，而不需要添加其他輔酶。18 h內DHA的質量濃度達到27.21 g／L，甘油轉化率為52.93%。

與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵法和酶法相比，電耦聯法生產過程中產生的副產物較少，有利于DHA分離和純化；且操作簡單不需要添加大量輔酶，有利于節(jié)約成本。

作者只針對生物電化學法催化甘油生成DHA可行性進行了初步研究，生物電化學法應用于生產中仍需要對膜結合甘油脫氫酶的分離純化以及反應條件進一步研究和優(yōu)化。

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Bio－Electrochemical Synthesis of 1，3－Dihydroxyacetone from Glycerol

ZHANGYu－wei1，2，YANGXue－peng2，WEIDong－zhi2，AIZhi－lu＊1

（1.College of Food Science and Technology，He＇nan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；2，College of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China）

The membrane－bound glycerol dehydrogenase（GDH）was the key enzyme of biocon version of glycerol to 1，3－dihydroxyacetone byGluconobacteroxydans.The membrane fraction ofGluconobacteroxydanswas collected by ultra－centrifugation，and GDH was isolated from the membrane fraction and purified by CM－cellulose column and Sephacryl HR 400 column chromatography.The electrochemical regeneration of the membrane－bound glycerol dehydro genase was studied by cyclic voltammetry.Using this system，the bio－electrochemical preparation of 1，3－dihydroxyacetone（DHA）from glycerol without coenzyme was investigated.When the temperature was 28±2℃，during 18 h，the DHA production reached at 27.21g／L and the conversion rate of glycerol was 52.93%.

1，3－dihydroxyacetone，glycerol dehydrogenase，bio－electrochemistry，Gluconobacteroxydans

Q 815

A

1673－1689（2012）03－0266－05

2011－03－04

國家自然科學基金項目（20976053）；鄭州輕工業(yè)學院博士科研基金項目。

＊

艾志錄（1965－），男，河南輝縣人，工學博士，教授，碩士研究生導師，主要從事農產品精深加工方面的研究。E－mail：zhila＠163.com