常顯波, 劉文正, 尹 琦, 張曉華

(1. 中國海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院, 山東 青島 266003; 2. 煙臺大學(xué) 環(huán)境與材料工程學(xué)院, 山東 煙臺264005)

海洋放線菌不同分離方法的比較研究

常顯波1,2, 劉文正1, 尹 琦1, 張曉華1

(1. 中國海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院, 山東 青島 266003; 2. 煙臺大學(xué) 環(huán)境與材料工程學(xué)院, 山東 煙臺264005)

采用平板涂布法, 以青島海區(qū)潮間帶沉積物為對象進(jìn)行海洋放線菌的分離方法研究。具體分析了不同樣品預(yù)處理方式、稀釋液、海水濃度和培養(yǎng)基種類等對分離效果的影響。結(jié)果表明, 55℃預(yù)處理樣品6 min能有效減少細(xì)菌數(shù)量, 利于潮間帶沉積物中放線菌的分離; 以1/4 林格氏溶液稀釋樣品、純海水配置培養(yǎng)基, 可以分離得到較多的放線菌; 不同培養(yǎng)基對沉積物中放線菌的分離效果差別很大,本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的M1～M9培養(yǎng)基中, M1、M6、M7和M8培養(yǎng)基的分離效果優(yōu)于其他5種。

海洋沉積物; 放線菌; 分離方法

隨著從海洋環(huán)境中發(fā)現(xiàn)越來越多的新放線菌和活性產(chǎn)物, 海洋放線菌成為新藥開發(fā)和天然活性產(chǎn)物的重要來源[1-2]。由于海洋環(huán)境的特殊性, 目前對海洋放線菌的分離和培養(yǎng)仍然存在一些技術(shù)問題,有很大一部分海洋放線菌未能培養(yǎng)出來。因此從海洋環(huán)境中有效分離放線菌是放線菌研究的重要內(nèi)容。目前海洋放線菌的分離方法基本借鑒于陸生放線菌, 尚未有一個被廣泛接受的方法。本研究以青島海區(qū)潮間帶沉積物為對象, 探索和比較放線菌分離方法, 尋求適合于沉積物中放線菌分離的有效方法。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

樣品采自青島第一海水浴場附近潮間帶沉積物,去掉表層約5 cm, 用無菌的樣品勺采集5～20 cm處沉積物樣品1份, 用無菌三角燒瓶盛放, 放于冰盒保存, 并立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 不同因素對放線菌分離效果的影響實(shí)驗(yàn)

1.2.1 樣品預(yù)處理

采用3種方法預(yù)處理樣品： 將1 g樣品平鋪于無菌培養(yǎng)皿內(nèi), 真空干燥約24 h, 磨細(xì)成粉末; 將1 g樣品在55℃水浴中加熱6 min; 將1 g樣品平鋪于無菌培養(yǎng)皿內(nèi), 在 120℃干燥箱中加熱 1 h。分別將預(yù)處理后沉積物樣品, 用1/4林格氏溶液稀釋, 在純海水配置的M1培養(yǎng)基上進(jìn)行放線菌的分離。

1.2.2 培養(yǎng)基中海水濃度

采用 5種濃度(0、25%、50%、75%、100%)海水配置M1培養(yǎng)基。將經(jīng)過55℃水浴6 min的樣品,用1/4林格氏溶液稀釋, 分別涂布于不同濃度海水配置的M1培養(yǎng)基上進(jìn)行放線菌的分離。

1.2.3 樣品稀釋液

采用3種稀釋液進(jìn)行樣品稀釋： 無菌海水、無菌生理鹽水(0.85 % NaCl)、無菌1/4 林格氏溶液(0.9 %NaCl、0.04 % CaCl2、0.04 % KCl)。將經(jīng)過 55℃水浴6 min的樣品, 分別用3種稀釋液進(jìn)行稀釋, 在純海水配置的M1培養(yǎng)基上進(jìn)行放線菌的分離。

1.2.4 培養(yǎng)基

放線菌分離效果比較用的 9種培養(yǎng)基基礎(chǔ)成分示于表1。將樣品55℃水浴6 min, 用1/4 林格氏溶液稀釋, 分別涂布于純海水配制的不同培養(yǎng)基上進(jìn)行放線菌的分離。

所有分離培養(yǎng)基中均添加終質(zhì)量濃度為 25 mg/L的萘啶酮酸以抑制快速生長的細(xì)菌。同時(shí)添加終質(zhì)量濃度為100 mg/L的制霉菌素溶液以抑制真菌的生長[3]。

表1 沉積物海洋放線菌分離培養(yǎng)基Tab. 1 Media for the isolation of marine actinobacteria from sediments

1.3 放線菌菌株分離方法

放線菌的分離采用平板涂布法[5]。均稱取樣品10 g, 分別加入裝有玻璃珠的90 mL 無菌稀釋液中,150 r/min震蕩20 min后, 靜置30 min, 取上清液, 逐級稀釋至10-3, 各取100 μL涂布平板, 每個處理設(shè)3個重復(fù), 28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～15 d后進(jìn)行放線菌菌落計(jì)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析均在 SPSS 17.0 (SPSS Inc, Chicago, USA)上完成。

2 結(jié)果

2.1 不同預(yù)處理方式對樣品中放線菌分離效果的影響

從表 2可以看出, 用不同方式預(yù)處理底泥樣品對放線菌的分離有較大影響, 放線菌數(shù)量與不同預(yù)處理樣品方式間有顯著差異。其中, 樣品經(jīng)過 55℃水浴6 min所獲得的放線菌數(shù)量最多, 雖然還存在一定數(shù)量的細(xì)菌, 但細(xì)菌數(shù)量不會影響到放線菌的分離。樣品經(jīng)過120℃加熱處理1 h可以明顯地減少細(xì)菌數(shù)量, 但目標(biāo)放線菌的數(shù)量也隨之減少。樣品經(jīng)過真空干燥處理后細(xì)菌數(shù)量有明顯的減少, 但放線菌數(shù)量也比新鮮底泥中放線菌數(shù)量有所降低。樣品經(jīng)過 55℃水浴6 min分離到的放線菌數(shù)量與真空干燥和120℃加熱1 h處理樣品間差異顯著, 但3種方式預(yù)處理樣品對細(xì)菌數(shù)量的影響差異不顯著。

表2 不同預(yù)處理方式對放線菌分離效果的影響Tab. 2 Influence of different pretreaments on the isolation of marine actinomycetes

2.2 海水濃度對放線菌分離效果的影響

從表 2可以看出, 隨著培養(yǎng)基中海水比例的增加, 放線菌數(shù)量和細(xì)菌數(shù)量呈增加的趨勢, 但放線菌和細(xì)菌數(shù)量與培養(yǎng)基中海水比例之間沒有顯著差異。用100%海水配置的培養(yǎng)基中分離到的放線菌數(shù)量最多, 其次是 75%和 50%海水配置的培養(yǎng)基, 用蒸餾水和 25%海水配置的培養(yǎng)基中分離到的放線菌數(shù)量最少。

表3 海水濃度對放線菌分離效果的影響Tab. 3 Influence of seawater percentage level on the isolation of marine actinomycetes

2.3 不同稀釋液對放線菌分離效果的影響

從表 4可以看出, 不同稀釋液對放線菌的分離有影響, 但放線菌和細(xì)菌數(shù)量與稀釋液種類之間沒有顯著差異。1/4 林格氏溶液稀釋樣品獲得的放線菌數(shù)量最多, 而后依次為純海水和生理鹽水。

表4 不同稀釋液對放線菌分離效果的影響Tab. 4 Influence of different dilutents on the isolation of marine actinomycetes

2.4 不同培養(yǎng)基對放線菌分離效果的影響

表 5顯示了不同培養(yǎng)基分離到的放線菌數(shù)量。可見不同培養(yǎng)基對放線菌的分離效果差別很大, 放線菌數(shù)量與培養(yǎng)基種類有顯著差異。分離到放線菌數(shù)目較多的培養(yǎng)基為M1, 其次是M6、M8和M7, 而培養(yǎng)基M5和M9分離到的放線菌數(shù)量最少。培養(yǎng)基M1分離的放線菌數(shù)量除與培養(yǎng)基M6差異不顯著外,與其余各種參試培養(yǎng)基的差異均達(dá)到顯著水平。

表5 不同培養(yǎng)基對放線菌的分離效果的影響Tab. 5 Influence of different media on the isolation of marine actinomycetes

3 討論

目前從海洋環(huán)境中分離放線菌, 通常通過一些物理、化學(xué)方法預(yù)處理樣品。其優(yōu)點(diǎn)一方面可以選擇性分離稀有放線菌, 另一方面可以有效抑制雜菌的生長。放線菌是一類革蘭氏陽性細(xì)菌, 細(xì)胞壁較厚,主要以孢子形式萌發(fā), 其孢子具有耐熱、耐干燥的性質(zhì), 適當(dāng)?shù)臏囟忍幚砟艽碳し啪€菌孢子萌發(fā)。而一般細(xì)菌細(xì)胞壁相對較薄, 對熱、干燥環(huán)境比較敏感, 易發(fā)生質(zhì)壁分離而失去生命力。王海雁等[6]對南麂島海域沉積物樣品進(jìn)行了真空干燥、熱預(yù)處理發(fā)現(xiàn), 海洋沉積物經(jīng)干燥處理、50℃熱處理20 min均能有效地減少細(xì)菌數(shù)量, 利于海洋沉積物中放線菌的分離。Michael等[7]通過加熱和苯酚預(yù)處理海洋沉積物樣品,可以很好地抑制競爭性細(xì)菌的生長。本研究中, 底泥樣品經(jīng)過55℃處理6 min, 放線菌的分離效果明顯好于 120℃加熱處理 1h和真空干燥預(yù)處理, 樣品經(jīng)過55℃處理6 min有利于放線菌孢子的萌發(fā), 提高放線菌的檢出率, 同時(shí)對細(xì)菌的生長有一定的抑制作用。研究認(rèn)為, 放線菌的菌絲體會與環(huán)境樣品纏繞在一起形成團(tuán)粒結(jié)構(gòu), 如何打破團(tuán)粒結(jié)構(gòu)束縛、使菌絲體釋放出來, 是放線菌分離的重要條件之一。Maldonado等[8]利用分散差速離心(Dispersion and Differential Centrifugation, DDC)方法預(yù)處理海泥樣品, 結(jié)果表明 DDC法能很好地分散底泥樣品, 比傳統(tǒng)的震蕩分離方法更有效、是比較理想的海泥樣品預(yù)處理方法。

海水濃度能影響海洋放線菌生長環(huán)境的滲透壓,在配置海洋放線菌培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)該考慮所用海水的濃度。王海雁等[6]用不同比例海水配置培養(yǎng)基分離放線菌, 結(jié)果顯示 60%陳海水配置的培養(yǎng)基中, 放線菌分離數(shù)量明顯高于純海水配置的培養(yǎng)基。但在本研究中用不同比例海水配置的培養(yǎng)基分離到的放線菌數(shù)量有差異, 但差異不顯著。為了模擬海洋環(huán)境, 提高鹽度和滲透壓, 更多地分離出海洋放線菌, 用純海水配置培養(yǎng)基是比較好的選擇。

放線菌的分離培養(yǎng)基多種多樣, 培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)組成和比例對于放線菌的分離效果有著重要影響。Abdelmohsen等[9]利用8種培養(yǎng)基對11種海綿來源放線菌多樣性進(jìn)行了研究, 結(jié)果表明不同種類培養(yǎng)基在分離放線菌的數(shù)量和多樣性上有很大差異,用培養(yǎng)基M1分離出11個屬、27株放線菌, 而培養(yǎng)基MA僅分離出1屬、2株放線菌。Jensen等[3]利用加入了沉積物和海砂洗脫液培養(yǎng)基對關(guān)島海底沉積物進(jìn)行研究, 結(jié)果表明分離的菌株中有高比例(82%～91%)的放線菌屬于海洋特有放線菌。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn), 在培養(yǎng)基中加入低比例的營養(yǎng)成分能分離出更多的海洋特有放線菌。在本研究的 9種分離培養(yǎng)基中, 培養(yǎng)基M1、M6、M7和M8上分離到的放線菌菌數(shù)量較多, 其中M1和M6的主要碳源為可溶性淀粉和棉子糖, 這是放線菌偏好的營養(yǎng)成分[10]。M8中含有放線菌比較喜好的兩種營養(yǎng)成分： 精氨酸和甘油[11], 分離得到放線菌的數(shù)量也比較高, 很多研究者也都發(fā)現(xiàn)甘油-精氨酸培養(yǎng)基的分離效果較好[12-14]。在M7中含有能抑制真菌生長的丙酸鈉[15], 有利于放線菌的分離。培養(yǎng)基M1和M9的分離效果差別很大, 其營養(yǎng)成分的主要差別是KNO3和K2HPO4的含量, 可能由于M1培養(yǎng)基中含有較高比例的K、P等必須離子的無機(jī)鹽, 有利于放線菌生長繁殖。

本實(shí)驗(yàn)指出, 用 1/4 林格氏溶液稀釋樣品的分離效果好于用純海水和生理鹽水稀釋。在國外很多對海洋放線菌的研究中[4,16], 均采用1/4 林格氏溶液稀釋樣品, 相比較純海水和生理鹽水, 1/4 林格氏溶液稀釋樣品可能更有利于活化放線菌的休眠孢子,但具體機(jī)制尚待研究。

作者利用上述分離方法研究了黃海冷水團(tuán)和北極海區(qū)沉積物中放線菌的多樣性, 取得了很好的分離效果, 并從黃海冷水團(tuán)沉積物中分離到一個海洋放線菌新屬[17]。研究結(jié)果表明, 在這兩個海區(qū)中存在著豐富的放線菌和新菌資源, 許多菌株對病原菌有抑菌活性并能產(chǎn)生多種胞外酶,具有非常巨大的開發(fā)利用前景。

[1]Goodfellow M, Fiedler H P. A guide to successful bioprospecting： informed by actinobacterial systematic[J].Antonie van Leeuwenhoek, 2010, 98： 119-142.

[2]Solanki R, Khanna M, Lal R. Bioactive compounds from marine actinomycetes[J]. Indian J Microbiol, 2008,48： 410-431.

[3]Jensen P R, Gontang E, Mafans C, et al. Culturable marine actinomycete diversity from tropical Pacific Ocean sediments[J]. Environ Microbiol, 2005, 7：1039-1048.

[4]Maldonado L A, Frangoso Y D, Perez-Garcia A, et al.Actinobacterial diversity from marine sediments collected in Mexico[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2009,5： 111-120.

[5]周德慶. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京： 高等教育出版社, 2006.

[6]王海雁, 劉健, 趙淑江. 南麂島海域沉積物中海洋放線菌的分離研究[J].海洋科學(xué), 2010, 34(1)： 48-51.

[7]Michael A P, Michael J S, Madelyn M L. Application of pretreatments for the isolation of bioactive actinomycetes from marine sediments[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1986, 25： 285-288.

[8]Maldonado L A, Stach J E, Pathom-aree W, et al. Diversity of cultivable actinobacteria in geographically widespread marine sediments[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2005, 87： 11-18.

[9]Abdelmohsen U R, Pimentel-Elardo S M, Hanora A, et al. Isolation, phylogenetic analysis and anti-infective activity screening of marine sponge-associated actinomycetes[J]. Mar Drugs, 2010, 8： 399-412.

[10]楊宇容, 徐麗華, 李啟任, 等. 放線菌分離方法的研究[J].微生物學(xué)通報(bào), 1995, 22(2)： 88-91.

[11]Takahashi Y, Omura S. Isolation of new actinomycete strains for the screening of new bioactive compounds[J].J Gen Appl Microbiol, 2003, 49： 141-154.

[12]Sun W, Dai S K, Jiang S M, et al. Culture-dependent and culture-independent diversity of actinobacteria associated with the marine spongeHymeniacidon perlevefrom the South China Sea[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2010, 98： 65-75.

[13]王宏梅, 趙心清. 可培養(yǎng)海洋放線菌生物多樣性的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2007, 34(5)： 996-1000.

[14]Zhang H, Lee Y K, Zhang W, et al. Culturable actinobacteria from the marine spongeHymeniacidon perleve： isolation and phylogenetic diversity by 16S rRNA gene-RFLP analysis[J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 2006, 90(2)： 159-169.

[15]Zakharova O S, Zenova G M, Zvyagintsev D G. Some Approaches to the selective isolation of actinomycetes of the genus Actinomadura from soil[J]. Microbiology,2003, 72： 110-113.

[16]Bredholdt H, Galatenko O A, Engelhardt K, et al. Rare actinomycete bacteria from the shallow water sediments of the Trondheim fjord, Norway： isolation, diversity and biological activity[J]. Environ Microbiol,2007, 9： 2756-2764.

[17]Chang X B, Liu W Z, Zhang X H.Spinactinospora alkalitoleransgen. nov. sp. nov., a novel marine actinomycete isolated from sediment near the Yellow Sea Cold Water Mass, China[J]. Int J Syst Evol Microbiol,2012, 62： 954-959.

Comparative study of different methods for isolation of marine actinomycetes

CHANG Xian-bo1,2, LIU Wen-zheng1, YIN Qi1, ZHANG Xiao-Hua1
(1. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. College of Environmental & Material Engineering, Yantai University, Yantai 264005, China)

May, 4, 2011

marine sediment; actinomycete; isolation method

The isolation techniques for marine actinomycetes from the inter-tidal sediment at Qingdao were studied by using the series dilution and plate spreading methods. The impacts of different pretreatments, diluents, seawater concentrations and media on the isolation of actinomycetes were investigated. The results showed that the growth of bacteria were obviously restrained in the samples when pretreated with 55°C for 6 minutes, which enhanced the isolation of actinomycetes from the inter-tidal sediment; dilution of the samples with 1/4 Ringer's solution and spreading them on the media prepared with pure seawater could improve the isolation of actinomycetes. The 9 media exhibited significant differences on the number of actinomycetes recovered, with media M1, M6, M7 and M8 being more effective than others.

P736. 2; Q939. 1

A

1000-3096(2012)08-0035-05

2011-05-04;

2011-11-14

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(2007AA09Z434); 國家海洋局海洋生物活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目(MBSMAT-2010-02); 煙臺大學(xué)博士啟動基金資助項(xiàng)目(HJ11B26)

常顯波(1978-), 女, 山東即墨人, 講師, 在讀博士, 從事放線菌資源與應(yīng)用研究 ,電 話：15063835727, E-mail：cxb780806@126.com; 張曉華, 通信作者, 教授, E-mail：xhzhang@ouc.edu.cn

譚雪靜)