李三磊, 徐冬冬 樓 寶 王偉定 辛 儉 毛國民 詹 煒

(1. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所, 浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室, 浙江 舟山 316100; 2. 浙江海洋學院, 浙江 舟山316004)

舟山近海條石鯛野生群體與人工放流群體遺傳多樣性的AFLP分析

李三磊1,2, 徐冬冬1, 樓 寶1, 王偉定1, 辛 儉1, 毛國民1, 詹 煒1

(1. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所, 浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室, 浙江 舟山 316100; 2. 浙江海洋學院, 浙江 舟山316004)

利用 AFLP技術(shù)對舟山近海條石鯛(Oplegnathus fasciatus)野生和放流群體的遺傳多樣性進行比較分析, 旨在為條石鯛的人工增殖及其種質(zhì)資源的保護和利用提供遺傳學的基礎資料。采用 8對引物組合在2個群體中共擴增得到位點316個, 多態(tài)性位點為162個, 多態(tài)性比例為51.67%。野生群體和放流群體的多態(tài)性位點比例(P), Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s多樣性指數(shù)(I)分別為46.75%和44.67%, 0.097和 0.089, 0.16和 0.15。野生群體的遺傳多樣性水平略高于放流群體, 但差異并不顯著(P＞0.05)。兩群體間的遺傳相似系數(shù)(S)和遺傳距離(D)分別為0.99和0.0073; 基因分化系數(shù)(Gst)為0.036,群體間無顯著遺傳分化(P＞0.05)。分子方差(AMOVA)分析表明96.82%的遺傳變異來源于群體內(nèi)的個體間, 群體間無顯著的遺傳差異(P＞0.05)。以上研究結(jié)果表明條石鯛的放流群體與野生群體間無明顯的遺傳分化, 放流群體的遺傳多樣性水平尚處于一個合理狀態(tài)。但為了避免放流群體對野生群體產(chǎn)生負面的遺傳效應, 應當增加放流群體繁育親本的數(shù)量, 并對放流群體的遺傳變異水平進行持續(xù)監(jiān)測。

條石鯛(Oplegnathus fasciatus); 野生群體; 人工放流群體; 遺傳多樣性; AFLP

針對目前海洋漁業(yè)資源衰退現(xiàn)狀, 世界各國政府均實施積極的資源養(yǎng)護和漁業(yè)管理措施, 優(yōu)化漁業(yè)資源結(jié)構(gòu), 改善海域生態(tài)環(huán)境, 恢復日趨衰退的海洋漁業(yè)資源。其中, 人工增殖放流是恢復漁業(yè)資源最為直接有效的措施。但是, 增殖放流的苗種來自于人工繁育, 從保護生態(tài)學角度來看, 由于放養(yǎng)魚類與野生魚類之間存在遺傳差異, 可能對自然群體產(chǎn)生負面影響, 使魚類基因庫的遺傳變異降低, 從而直接影響到野生群體的遺傳多樣性水平[1-2]。

一直以來, 養(yǎng)殖群體對野生群體的遺傳效應備受研究人員關(guān)注, 因放養(yǎng)而導致的負面遺傳影響的證據(jù)日益增多。在大西洋鮭中, 多代連續(xù)的人工養(yǎng)殖造成養(yǎng)殖群體 42%的等位基因丟失, 當這些苗種放流或逃逸到自然界時, 對野生群體的遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響, 導致野生群體的數(shù)量降低[3-4]。日本學者研究發(fā)現(xiàn)條斑星鰈(Verasper moseri)放流回捕群體的遺傳變異水平和有效群體大小較低, 具有引起近交衰退的風險[5]。中國學者吳旭等[6]研究發(fā)現(xiàn), 肖四海湖野生和放流的鱖群體的遺傳結(jié)構(gòu)存在顯著分化。Fritzner等[7]研究認為, 為避免人工增殖群體與野生群體的基因庫混雜, 在實施增殖時, 應對人工放流群體進行遺傳多樣性評估, 從而確保野生群體的遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。因此, 采用適當、適時監(jiān)控, 研究放流群體與野生群體的遺傳異質(zhì)性, 了解放流物種資源的遺傳結(jié)構(gòu)及其遺傳多樣性狀況, 對評估增殖放流效果、豐富海洋生物的遺傳學背景資料具有著重要的作用。

條石鯛(Oplegnathus fasciatus), 隸屬于鱸形目(Perciformes)、石鯛科(Oplegnathidae)、石鯛屬(Oplegnathus), 俗稱日本鸚鵡魚, 自然分布于太平洋和印度洋沿岸, 中國產(chǎn)于黃海、東海和臺灣海峽, 是一種暖溫性海洋中下層的島礁性魚類[8-9]。近年來,由于環(huán)境污染、氣候條件變化及過渡捕撈等原因, 造成包括條石鯛在內(nèi)的野生經(jīng)濟魚類資源急劇衰退。條石鯛被農(nóng)業(yè)部確定為重要的人工增殖放流品種,自 2006年起連續(xù)多年在舟山海域進行人工增殖放流。目前, 有關(guān)條石鯛的研究主要涉及早期發(fā)育[10-11]、人工繁育[12]及養(yǎng)殖[13-14]等方面。關(guān)于其群體遺傳學的研究報道僅見于孫鵬等[15-16]利用線粒體控制區(qū)域序列分析技術(shù)研究了條石鯛單一性群體的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)。有關(guān)條石鯛野生群體和人工放流群體的遺傳多樣性的比較分析尚未見報道。本研究利用 AFLP技術(shù)對舟山近海的條石鯛野生群體和放流群體的遺傳多樣性進行比較分析, 探討野生群體和放流群體的遺傳差異, 為條石鯛人工增殖提供科學指導, 并為其種質(zhì)資源的保護和利用提供遺傳學的基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用的一個條石鯛群體于2005年采自舟山附近海區(qū), 取樣前未曾進行條石鯛的人工放流活動,故所取樣本可以認定為野生群體, 共 30尾, 平均體長為18.35 cm±1.32 cm。另一個群體為人工放流群體,由舟山市水產(chǎn)研究所于2010年人工繁育所得, 共30尾, 平均體長為5.53 cm±0.52 cm。人工放流群體的親魚為舟山嵊泗附近海域放流前捕獲的野生魚馴養(yǎng)而成, 共32尾, 雌性與雄性的比例約為2 ：1。對采集樣本取肌肉或尾鰭, –20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取

基因組DNA采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取(TIANGEN, 北京), 然后用 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 并利用紫外分光光度計測定 DNA濃度和純度, 用雙蒸水稀釋至50 mg/L備用。

1.3 AFLP分析

AFLP分析參照Vos等[17]的方法。根據(jù)預實驗結(jié)果, 選取選擇性引物組合 E-AAC/ M-CTC、E-AAC/M-CTG、E-ACA/ M-CAT、E-ACA/ M-CTT、E-ACC/M-CAT、E-ACC/ M-CTT、E-AGA/ M-CAT 和 E-AGA/M-CTT用于AFLP分析。選擇性擴增產(chǎn)物經(jīng)6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染顯色, 將獲得清晰條帶的膠板進行拍照并記錄結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

根據(jù)電泳圖譜中擴增條帶的有無分別記錄為“1”和“0”, 所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計后形成矩陣, 統(tǒng)計多態(tài)性位點數(shù), 計算顯性基因型頻率等參數(shù)。利用Popgen1.32[18]軟件計算多態(tài)性位點比例 (P)、Shannon’s多樣性指數(shù) (I)[19]、Nei’s[20]基因多樣性指數(shù) (H)、Nei’s[21]遺傳距離 (D) 及遺傳相似系數(shù) (S)、Nei’s[22]基因分化系數(shù) (Gst) 等遺傳參數(shù), 利用 Arlequin3.1[23]軟件進行 AMOVA分析?；趥€體間的遺傳距離, 利用Mega3.1[24]軟件構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP擴增結(jié)果

利用篩選出的 8對選擇性引物組合, 在兩個群體的60個個體中共得到316個清晰位點, 其中多態(tài)性位點為162個, 多態(tài)性比例為51.67%(圖1)。不同引物的擴增位點數(shù)從33到52不等, 擴增出的多態(tài)性位點數(shù)為 14～28不等, 檢出的多態(tài)性比例范圍為38.89%～68.29% (表1)。野生和放流群體中分別擴增出多態(tài)性位點數(shù)為144個和134個, 多態(tài)性比例分別為46.75%和44.67%, 野生群體中擴增的多態(tài)性比例略高于人工放流群體, 但差異并不顯著 (df =1,χ2=0.23,P＞0.05)。

圖1 引物組合E-AGA/M-CTT擴增得到的條石鯛AFLP指紋圖譜Fig. 1 AFLP patterns of Oplegnathus fasciatus using primer set E-AGA/M-CTT

2.2 野生群體與放流群體的遺傳變異分析

條石鯛野生群體與放流群體的 Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和 Shannon’s多樣性指數(shù)(I)分別為 0.097和 0.089, 0.16和0.15(表2)。野生群體的 Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和 Shannon’s多樣性指數(shù)(I)略高于放流群體。兩群體間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離分別為0.99和0.0073, 基因分化系數(shù)Gst為0.036, 兩群體間無顯著遺傳分化(P＞0.05); AMOVA分析結(jié)果表明96.82%的遺傳變異來源于群體內(nèi)的個體間, 僅有3.16%的遺傳變異來自群體間, 兩群體間無顯著遺傳差異 (P＞0.05, 表3)。

表1 不同引物組合的擴增結(jié)果Tab. 1 Amplification results of different primer combinations

表2 條石鯛兩個群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab. 2 Parameters of genetic diversity in two populations of Oplegnathus fasciatus

表3 條石鯛兩個群體遺傳變異的AMOVA分析Tab. 3 Analysis of molecular variance (AMOVA) in two populations of Oplegnathus fasciatus

將 316個擴增位點的顯性基因型頻率以 10%為單位劃分區(qū)間, 0和100%分別設為一個單獨的區(qū)間,共劃分12個區(qū)間, 統(tǒng)計顯性基因型頻率位于各區(qū)間內(nèi)的位點數(shù)。結(jié)果顯示, 兩個群體擴增位點數(shù)在不同顯性基因型頻率區(qū)間的分布呈現(xiàn)一定的規(guī)律, 反映了兩個群體的遺傳結(jié)構(gòu)特點 (圖2)。野生群體在1%～9%區(qū)間的擴增位點數(shù)呈現(xiàn)峰值, 放流群體在20%～29%區(qū)間的擴增位點數(shù)呈現(xiàn)峰值, 兩個群體在30%～100%區(qū)間的擴增位點數(shù)分布變化趨勢基本一致。從擴增位點數(shù)在不同顯性基因頻率區(qū)間的分布來看, 放流群體的低頻率顯性位點數(shù)比野生群體的少, 表明野生群體的顯性基因頻率分布相對放流群

2.3 野生群體與放流群體的聚類分析

利用MEGA3.1軟件基于條石鯛60個個體間的遺傳距離, 構(gòu)建了UPGMA系統(tǒng)樹如圖3。系統(tǒng)樹結(jié)果顯示, 60個個體分為兩支, 兩個群體的個體分散于兩個分支, 沒有出現(xiàn)群體聚類的現(xiàn)象, 表明兩個群體沒有出現(xiàn)明顯的遺傳分化, 具有較近的親緣關(guān)系。

圖2 擴增位點數(shù)在不同顯性基因頻率區(qū)間內(nèi)的分布Fig. 2 Distributions of amplified loci in different frequency of intervals

圖3 條石鯛60個個體的UPGMA聚類樹Fig. 3 UPGMA dendrogram of 60 individuals of Oplegnathus fasciatus

3 討論

本實驗利用 8對 AFLP選擇性引物組合對舟山近海條石鯛野生群體與人工放流群體的遺傳多樣性進行分析, 在 60個個體中共得到擴增位點 362個,不同引物組合擴增位點數(shù)從33到52不等, 多態(tài)性位點數(shù)為14～28不等, 每對引物平均得到擴增位點數(shù)和多態(tài)性位點數(shù)分別約為40和20, AFLP標記表現(xiàn)出了豐富的多態(tài)性和較高的靈敏度。

多態(tài)性位點比例(P)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和 Shannon’s多樣性指數(shù) (I) 是衡量群體遺傳多樣性的重要參數(shù), 反映了群體在數(shù)個基因座位上的遺傳變異, 其值大小可以反映群體遺傳變異的高低。本研究中, 條石鯛野生群體的多態(tài)性位點比例為46.75%, Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H) 和 Shannon’s多樣性指數(shù)(I)分別為0.097和0.16。與中國近海魚類現(xiàn)有的 AFLP分析數(shù)據(jù)相比, 條石鯛的遺傳多樣性水平較真鯛(Pagrus major) (P=58.4%～64.0%)[25]、小黃魚(Larimichthys polyactis) (P=55.34～60.09%,H=0.12～0.14)[26]、銀鯧 (Pampus argenteus) (P=62.9%～67.0%,I=0.23～0.25)[27]低, 與黃姑魚 (Nibea albiflora)(P=51.70%,H=0.10)[28]相當, 但較褐牙鲆(Paralich-thys olivaceus) (P=40.29～44.31%)[29]和 馬 鮫 魚(Scomberomorus niphonius) (P=38.54%～45.70%,H=0.081～0.098)[30]高。這表明條石鯛的野生群體的遺傳變異水平相對略高。孫鵬等[15]利用線粒體COⅠ基因和Cytb基因?qū)χ凵胶Ｓ虻臈l石鯛野生群體進行群體遺傳學分析也表明其野生群體具有較高的遺傳多樣性水平。這可能與海洋魚類的生境面積廣大且種群分布分散有關(guān)[26-28]。

物種的遺傳多樣性高低與其適應能力、生存能力和進化潛力密切相關(guān)。野生種群遺傳多樣性水平的減少可能導致魚類成活率、生長與繁殖效率變低,降低種群個體對變化的環(huán)境的適應能力[31]。由于放流的苗種來自人工養(yǎng)殖, 許多研究表明養(yǎng)殖群體的遺傳變異水平低于野生群體, 如大西洋鮭(Salmo salarL.)[3]、褐牙鲆[29,32]等, 因此, 放流苗種可能對野生群體產(chǎn)生負面的遺傳影響。本研究中, 比較條石鯛兩個群體的擴增多態(tài)位點數(shù)、多態(tài)性位點比例(P)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和 Shannon’s多樣性指數(shù)(I)等參數(shù)發(fā)現(xiàn)野生群體的遺傳變異水平略高于放流群體, 但差異不顯著, 群體間無明顯的遺傳分化,這可能是由于人工放流群體的繁育親魚與野生群體來自同一海域有關(guān); 然而, 放流群體中1%～9%低頻位點數(shù)略低于野生群體, 這可視為隱性純合位點過剩, 稀有位點的丟失, 致使放流群體的遺傳多樣性水平會略低于野生群體, 這可能由于放流群體培育過程中親魚數(shù)量限制及繁殖過程中的一些不合理因素(如親魚大小、親魚雌雄比例、遺傳漂變等)所致[31-33]。條石鯛野生群體稀有位點對整個群體的遺傳變異水平影響不算大, 但對于整個基因庫卻很重要。因此, 對該條石鯛人工放流群體的遺傳多樣性水平處于一個合理狀態(tài)的現(xiàn)狀也不能過于樂觀。

人工增殖放流是快速恢復種群數(shù)量的有效方法,然而, 人工放流的遺傳效應一直存在爭議。Gonzalez[34]研究發(fā)現(xiàn)：雖然近 30年的人工放流使日本海域黑鯛(Acanthopagrus schlegelii)種群數(shù)量增加,但也導致其自然群體的遺傳變異水平有所下降。Kitada[35]對真鯛和太平洋鯡(Clupea pallasi)增殖放流的遺傳效應進行跟蹤研究, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)放流群體并未影響野生群體的遺傳多樣性。保證人工放流群體的遺傳多樣性水平可以避免其對野生群體遺傳危害。從種質(zhì)資源保護的角度出發(fā), 進行人工放流時用于人工繁育的親本應當直接從自然群體中選擇, 不要采用養(yǎng)殖的子代作為親本, 且親本數(shù)量不宜過少,一般推薦的親本數(shù)量在50～350尾[31,36]。本研究中,條石鯛放流群體的親本與野生群體來自同一海域,且放流群體的遺傳多樣性水平尚處于較為合理的狀態(tài), 可能不會對野生群體的遺傳結(jié)構(gòu)造成影響。但為了避免放流群體對自然群體遺傳多樣性的負面影響,應當增加繁育親本的數(shù)量; 而且, 在今后的放流過程中要對放流群體的遺傳變異水平進行持續(xù)監(jiān)測。

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The genetic diversity of wild and hatchery-releasedOplegnathus fasciatusfrom inshore water of Zhoushan revealed by AFLP

LI San-lei1,2, XU Dong-dong1, LOU Bao1, WANG Wei-ding1, XIN Jian1,MAO Guo-min1, ZHAN Wei1
(1. Marine Fishery Institute of Zhejiang Province, Zhejiang Province Key Lab of Mariculture and Enhancement,Zhoushan 316100, China; 2. Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316004, China)

Apr.,18, 2011

Oplegnathus fasciatus; wild population; hatchery-released population; genetic diversity; AFLP

The genetic variations of wild and hatchery-releasedOplegnathus fasciatusfrom inshore water of Zhoushan were analyzed using amplified fragment length polymorphism (AFLP) to provide basic genetic information for the population enhancement and genetic resource protection and utilization in this fish species. A total of 316 loci were generated in the two populations using 8 primer combinations, among which 162 (51.67%) were polymorphic.The percentages of polymorphic loci in the wild or hatchery-released populations were 46.75% or 44.67%, respectively. The genetic diversities in terms of Nei’s gene diversity and Shannon’s diversity index in the wild population were 0.097 and 0.16, respectively. The corresponding values in hatchery-released population were 0.089 and 0.15,respectively. These results showed that the genetic diversity in the wild population was slightly higher than that in the hatchery-released population, but the difference in genetic diversity of the two populations was not significant(P＞0.05). The genetic similarity coefficient and genetic distance between the two populations were 0.99 and 0.0073,respectively. The value ofGst coefficient was 0.036, which indicated no significant genetic differentiation between the two populations (P＞0.05). The analysis of molecular variance (AMOVA) showed that 96.82% of the genetic variation occurred among individuals within populations, which also revealed no significant genetic variation between the two populations (P＞0.05). The genetic diversity of hatchery-released population was at a reasonable level of state and genetic differentiation was not significant between the wild and hatchery-released populations. It was noticeable to take approaches to avoid the potential negative genetic effects of hatchery-released on wild populations. The number of parental fish should increase and the genetic variation level of hatchery-released population ought to be continuously monitored in the future.

Q953 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3096(2012)08-0021-07

2011-04-18;

2011-10-20

國家科技支撐計劃資助項目(2011BAD13B08); 國家海洋公益性行業(yè)科研專項(201005013); 國家自然科學基金資助項目(41106114); 浙江省科技計劃資助項目(2010F20006); 浙江省海水養(yǎng)殖重點科技創(chuàng)新團隊項目(2010R50025)

李三磊(1985-), 男, 山東泰安人, 碩士, 主要從事魚類遺傳育種研究, 電話：0580-3050985, E-mail：sanjun198563@126.com; 樓寶,通信作者,電話：0580-3050985, E-mail：loubao6577@163.com

譚雪靜)