陳塏鈿 宗凌 杜進濤周蔚 姜鴻彥

1 中山大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科醫(yī)院, 中山大學耳鼻咽喉科學研究所(廣州 510080)

遺傳性聾是一類具有高度遺傳異質(zhì)性的疾病，開展遺傳性聾的基因篩查，可明確大約50%的耳聾病因，為耳聾患者的臨床治療和預防提供參考。對GJB2、SLC26A4、線粒體DNA基因的多位點的篩查可明確大部分基因突變[1～4]。常用篩查方法包括Sanger測序法、基因芯片、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)、變性高效液相色譜分析(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)等。目前對散發(fā)的耳聾病例進行大樣本的基因篩查及突變頻率檢測，通常需要對每個樣本進行單獨的檢測，再分析實際突變率，需要耗費大量的人力和物力。焦磷酸測序(Pyrosequencing)技術(Qiagen公司，德國)是一種有效的基因篩查工具，擁有快速、多位點、位點突變頻率定量等優(yōu)點[5～7]。焦磷酸測序技術對多個DNA樣本混合后進行同一位點的突變篩查，具有很好的一致性[8～10]。本文旨在研究焦磷酸測序技術的單個樣本、多樣本混合測序、突變位點頻率定量分析在遺傳性聾基因篩查中的可行性，進一步制定針對耳聾常見突變位點的焦磷酸測序技術篩查的標準曲線，將這種方法引入遺傳性聾的大規(guī)模散發(fā)病例篩查中，為今后的基因篩查提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象及檢測方法 選擇100例散發(fā)非綜合征型聾患者的DNA樣本。病例基因檢測結果均通過Sanger測序法驗證。DNA樣本采用分光光度計定量和定性。測序位點選擇突變頻率高發(fā)的SLC26A4 IVS7-2A位點和頻率低的GJB3 538C、547G位點，采用焦磷酸測序技術對兩種不同頻率位點的基因病變進行檢測。按照Pyromark儀器附帶軟件(焦磷酸測序TMAssay Design Software Version 1.0)，設計SLC26A4 IVS7-2A>G、GJB3 538C>T、547G>A對應引物(正向、反向和測序引物)，引物序列見表1。SLC26A4 IVS7-2A>G測序序列為TC「T>C」GAAAT(反義鏈)，GJB3 538C>T，547G>A C「C>T」GACCTACC 「G>A」AGAA(正義鏈)。，PCR反應條件為：94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,45個循環(huán)后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認。焦磷酸測序采用SNP模式，測序步驟詳見機器說明，測序完畢，采用AQ模式進行突變位點頻率定量。

表1 SLC26A4 IVS7-2A>G、GJB3 538C>T、547G>A引物

首先，利用焦磷酸測序技術遺傳分析系統(tǒng)對這些病例分別進行單個體的SLC26A4 IVS7-2A>G、GJB3 538C>T、547G>A位點的SNP分析和位點頻率定量(AQ模式)。SLC26A4 IVS7-2A>G位點檢測中，SNP及AQ模式由機器附帶軟件自行判斷，根據(jù)位點相對熒光比值(C-T)/(C+T)判讀結果。SNP結果與Sanger測序法結果比較，分析相關性，建立特定的標準曲線。

將100例DNA樣本按10、20、50、100個DNA樣本進行等量(200 ng/樣本)混合，分別得到10個、5個、2個和1個DNA池，共18個樣本池。由于SLC26A4 IVS7-2A>G突變在遺傳性聾病例中較為常見，在該位點的DNA池中選擇性分配病例(正常、雜合和純合突變)，獲得11.1%～92.8%的突變率，模擬不同突變率混合樣本的篩查。利用焦磷酸測序技術進行SNP分析，AQ模式定量。每個DNA樣本池至少重復三次，并設立空白對照孔，收集Pyromark儀器結果自動分析認為“Pass”(通過)的數(shù)據(jù)。

1.2 統(tǒng)計學方法 突變位點頻率以平均值±標準差表示，以Sanger測序法結果為標準，采用SPSS 13.0軟件對AQ結果進行單樣本t檢驗，Pearson方法進行線性回歸及相關性分析。

2 結果

經(jīng)Sanger測序法確認100例病例中SLC26A4 IVS7-2A位點正常58例，SLC26A4 IVS7-2A>G雜合突變28例，SLC26A4 IVS7-2A>G純合突變14例。應用焦磷酸測序技術對100例病例的SLC26A4 IVS7-2A位點進行SNP分析及AQ定量的結果提示，SNP結果與Sanger測序法結果一致，準確率為100% (圖1)。

圖1 焦磷酸測序技術SNP分析SLC26A4 IVS7-2A位點與Sanger測序法結果a、b和c圖分別對應純合突變、雜合突變和正常結果。左側為焦磷酸測序技術檢測結果，右側為Sanger測序法結果

將SLC26A4 IVS7-2A>G位點AQ模式突變位點頻率定量(C-T)/(C+T)的相對熒光比值結果與Sanger測序法結果(按正常=0，雜合=50%，純合=100%)比較，位點正常的樣本(C-T)/(C+T)的相對熒光比值為7.13%±3.53% (N=58，95% CI：6.21%～8.05%，P<0.01)，雜合突變病例為49.5%±2.95% (N=28，95% CI：-1.69%～0.60%，P=0.339)，純合突變病例為93.7%±4.44% (N=14，95% CI：-8.83%～-3.70%，P<0.01)，實際基因突變頻率與焦磷酸測序技術相對熒光比值存在線性相關(圖2，r=0.994，P<0.01，N=100)。實際突變頻率x與相對熒光比值y的線性關系為y=6.984+0.861x。位點正常病例SNP樣本AQ讀取偏差為6.21%～8.05%，純合突變病例SNP結果偏差為-8.83%～-3.70%，與實際突變率存在統(tǒng)計學差異(P<0.01)，說明焦磷酸測序技術對熒光比值的判讀具有一定的誤差，但這并不影響焦磷酸測序技術對SNP結果的判斷。雜合突變SNP結果與Sanger測序法結果不存在統(tǒng)計學差異(P>0.05)，兩者一致性良好。

圖2 焦磷酸測序技術獲得的SLC26A4 IVS7-2A位點個體位點頻率定量標準曲線

進一步分析100個樣本的18個DNA池，計算每個位點重復三次的DNA池(C-T)/(C+T)的相對熒光比值的均值，與對應DNA池中樣本的個體相對熒光比值的平均值進行比較分析，兩者存在線性相關(圖3，r=0.892，P<0.01)。10個樣本混合的DNA池突變率與實際突變率間差異較大(0.6%～34.7%)，DNA池中突變率低(<30%)時偏倚更明顯。20個樣本的混合池，獲得的突變率與實際突變率一致性好。增加樣本至50個時，兩者的差異進一步減小。100例樣本的混合結果，DNA池突變率(42.7±0.65%)與實際突變率(34.9%)之間差異為7.8%，兩組數(shù)據(jù)落在線性方程曲線上?？梢姡S著樣本量的增大和突變率的增高，DNA池的突變率與實際突變率越接近。實際突變率y與DNA池突變率x的線性關系為：y=-0.003+0.801x。根據(jù)這個線性方程，可對大樣本量的DNA進行均勻混合，焦磷酸測序技術 AQ定量后推算出篩查樣本的突變率。

焦磷酸測序技術對GJB3 538和547位點的篩查同樣具有良好的一致性。從表2可以看出，混合樣本的篩查突變率(AQ定量)和實際突變率較一致 圖3 焦磷酸測序技術檢測SLC26A4 IVS7-2A位點個體和DNA池定量存在線性相關(實際突變率均數(shù)與AQ值差異95% CI范圍為-3.07%～-1.35%)。100例病例中未發(fā)現(xiàn)GJB3 538和547位點的突變，AQ定量的結果可作為正常人群GJB3篩查的參考。

表2 焦磷酸測序技術獲得的GJB3 538C>T，547G>A位點個體和DNA池定量

3 討論

臨床上在個體基因篩查中，焦磷酸測序技術具有省時(PCR產(chǎn)物處理到完成測序約需2小時)、低費用(平均1個位點15元)、準確性高等優(yōu)點。本研究結果顯示，焦磷酸測序技術的SNP結果與Sanger測序法一致性良好，可采用此方法進行大樣本的快速篩查，對發(fā)現(xiàn)突變的病例，進一步行Sanger測序法雙向驗證。從對個體耳聾基因診斷的角度考慮，焦磷酸測序技術具有很好的實用性。

焦磷酸測序技術的另一個優(yōu)點是可以對SNP位點進行突變頻率的定量分析[8～10]。這種方法對于線粒體DNA突變(如1555A>G突變)，判讀線粒體位點突變的同質(zhì)性、異質(zhì)性有很大作用[6]。雖然文獻已對焦磷酸測序技術的AQ定量模式做了相關的研究和驗證[8～10]，但是它在耳聾基因診斷中，是否也有同樣的價值暫無確切研究。本研究對100例耳聾病例采用Sanger測序法和焦磷酸測序技術定量進行SLC26A4 IVS7-2A位點篩查，Sanger測序法結果按正常為0、雜合突變?yōu)?0%、純合突變?yōu)?00%的假設，焦磷酸測序技術計算位點突變率采用的是該位點(C-T)/(C+T)的相對熒光比值，即：7.13%±3.53% (正常)，49.5%±2.95% (雜合)，93.7%±4.44% (純合)，兩者具有良好的相關性(r2=0.988，P<0.01)，說明焦磷酸測序技術的AQ定量與實際基因突變結果(線粒體DNA未列入研究)較為一致。

影響焦磷酸測序技術的AQ定量的因素有兩個[9]：第一，焦磷酸測序技術檢測位點突變模式是通過記錄該位點的焦磷酸誘發(fā)的熒光值，由機器判讀獲得結果。在PCR及單鏈分離過程中，多余的帶生物素標記的引物、殘留的焦磷酸及機器的熒光讀取誤差都可能影響獲得的峰值曲線。一個SNP樣本(如SNP位點為C>T)，正常的SNP實際檢測的結果仍可能檢測出少量的T值的熒光。第二，焦磷酸測序技術操作過程加入的dNTP堿基中，儀器對dATPs堿基的讀取敏感度偏高，獲得的dATPs峰值會偏高。在精確的定量中，有時需要對SNP的A堿基的結果進行調(diào)整。因此，焦磷酸測序技術的實際AQ結果容許存在5%左右的誤差[9]。此外，文獻建議對DNA濃度采用熒光定量方法(如Quant-iTTMPicoGreen)[8]，以避免DNA混合中的偏差，而分光光度計的DNA定量誤差相對偏大，這也是造成AQ模式與Sanger測序法結果差異的因素。

焦磷酸測序技術AQ模式還可用于多個樣本混合后的突變率測定[8,10～12]。本研究結果顯示，焦磷酸測序技術在遺傳性聾的突變檢測中，100例樣本的個體結果均值，與所有樣本混勻后的單個反應檢測值一致性良好(r=0.892，P<0.01)，且樣本量越大、突變率越高時，DNA池的突變率與實際突變率越接近。據(jù)此，臨床上大規(guī)模樣本的篩查研究中，可將每個個體少量DNA(<200 ng)混勻后，利用焦磷酸測序技術進行一次性的AQ定量，分析該人群中SNP突變率，根據(jù)該實驗的標準曲線，估計實際的可能的突變率。本實驗相對快速、便宜，節(jié)省人力和物力。研究獲得的SLC26A4 IVS7-2A>G實際突變率y與DNA池突變率x的線性關系為：y=-0.003+0.801x，假設人群篩查出的突變率為10%，實際人群中的突變率推算約為8.0%，篩查突變率為20%，實際突變率約為16.0%，依此類推，可估算出0～80.1%的實際樣本的總體突變率。當然這個曲線需要每個實驗室針對不同SNP定量后制定，其精確制定及臨床意義仍需進一步研究。

對于突變率低的樣本，焦磷酸測序技術同樣具有很好的適用性。從本研究結果看，GJB3 538C>T、547G>A位點的AQ定量與實際突變率的偏差范圍為-3.07%～-1.35% (95% CI)，說明AQ定量模式對于低突變率位點的篩查同樣適合，可作為正常人群的參考。

本研究從方法學研究的目的出發(fā)，選擇了遺傳性聾常見的突變位點SLC26A4 IVS7-2A>G和少見的突變GJB3 538、547位點，從兩方面探討了焦磷酸測序技術在高突變率和低突變率位點篩查的可行性和價值。選擇低突變率位點的重要意義在于，焦磷酸測序技術可對大批量的混合的DNA樣本進行總體突變率的篩查，對于罕見的基因突變的臨床大樣本篩查具有非常好的價值，值得進一步研究和推廣。

當然，焦磷酸測序技術在遺傳性聾的篩查應用中也存在不足。首先，焦磷酸測序技術應用限于短片段PCR產(chǎn)物(建議不超過200 bp)，無法對較長片段的產(chǎn)物進行精確的測序分析，這就限制了焦磷酸測序技術在基因測序中的廣泛應用。其次，焦磷酸測序技術對測序片段中連續(xù)的相同堿基(三個以上，如GJB2基因235delC位點的CCC，35delG的GGGGGG等)的判讀容易出現(xiàn)誤差，雖然這個缺點在引物設計時可以盡量最小化，但仍無法與傳統(tǒng)的Sanger測序法媲美。因此，在遺傳性聾的基因篩查中，需要明確焦磷酸測序技術的優(yōu)勢和適用性，根據(jù)篩查位點的特點，選擇合適的測序方法，優(yōu)化實驗條件，從而獲得預期的結果。

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