徐冬麗，陳海霞，時(shí) 偉，孫世春

（中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所，山東青島266003）

動(dòng)物線粒體基因組通常為閉合的雙鏈環(huán)形DNA分子，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳，基因成分相對(duì)穩(wěn)定，被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化研究［1－2］。迄今，GenBank中公布了2 200多種后生動(dòng)物線粒體全基因組序列。在已記錄的約1 275種［3］紐蟲中，僅有Cephalothrix hongkongiensis［4］、Lineus viridis［5］和Paranemertes cf.peregrina［6］3種完成了線粒體基因組全序列測(cè)序。另外，Turbeville和Smith［7］報(bào)道了Cephalothrix rufifrons長(zhǎng)度為10.1 kb的線粒體DNA連續(xù)片段，Chen et al.［6］測(cè)得了Cephalothrix sp.的線粒體DNA大部分序列（有一段預(yù)測(cè)長(zhǎng)度約500 bp的非編碼區(qū)未測(cè)出）。紐形動(dòng)物線粒體基因組研究在確定紐形動(dòng)物門在后生動(dòng)物中的系統(tǒng)地位方面已經(jīng)取得了有益結(jié)果（相關(guān)研究普遍支持紐形動(dòng)物屬于真體腔冠輪動(dòng)物L(fēng)ophotrochozoa）［4－5，7］，但現(xiàn)有的數(shù)據(jù)遠(yuǎn)不能滿足紐形動(dòng)物門子類群的系統(tǒng)發(fā)育分析。白額縱溝紐蟲（Lineus alborostratus Takakura，1898）（無針綱Anopla：異紐目Heteronemertea）是西北太平洋沿岸的一種常見紐蟲，本文將報(bào)道其線粒體基因組全序列，并分析其堿基組成、基因排列、t RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)編碼基因的密碼子使用特征等。目的在于為基于線粒體基因組數(shù)據(jù)的紐形動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育研究和紐形動(dòng)物線粒體基因組進(jìn)化研究積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基因組總DNA的提取

白額縱溝紐蟲標(biāo)本采自青島薛家島，使用D6032－01（OMEGA）試劑盒提取全基因組DNA，于－20℃保存。實(shí)驗(yàn)中所用DNA來自同一個(gè)體。

1.2 DNA擴(kuò)增和測(cè)序

首先用文獻(xiàn)報(bào)道的引物擴(kuò)增cox1、cox3、rrnS－rrn L 3個(gè)DNA片段，然后依據(jù)得到的序列設(shè)計(jì)特異性引物繼續(xù)擴(kuò)增，引物序列見表1。PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系為：模板總DNA 0.5μL，上下游引物（10μmol／L）各1μL，HSTMReaction Mix 12.5μL，Taq DNA酶（2.5 U／μL）0.25μL，加純水補(bǔ)至25μL。PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5 min，然后95℃變性30 s，48～54℃退火50 s，72℃延伸2 min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增的DNA片段用凝膠回收試劑盒（OMEGA）純化，與PMD18－T載體（Takara）連接后克隆，產(chǎn)物以ABI 3730測(cè)序儀測(cè)序（北京華大基因）。

1.3 序列拼接、分析

將測(cè)序得到的片段序列用Codon Code Aligner軟件進(jìn)行拼接并人工檢查，得到線粒體DNA全序列。利用t RNAScan－SE 1.21［10］網(wǎng)站服務(wù)器（http：／／lowelab.ucsc.edu／tRNAscan－SE／）搜索t RNA基因（得到21個(gè)）并預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)，用RNAStructure 4.5［11］推測(cè)剩余的tRNA基因結(jié)構(gòu)，結(jié)合RNAfold［12］查找及預(yù)測(cè)其他特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用NCBI的BLAST（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST）比對(duì)及相鄰基因的邊界確定rrn L和rrnS基因。利用DNASIS［13］識(shí)別蛋白質(zhì)編碼基因的起始密碼子和終止密碼子，并通過和相近物種的線粒體基因同源序列的比對(duì)來確定蛋白編碼基因。用DAMBE［14］和MEGA 4.0［15］軟件計(jì)算序列的堿基組成、蛋白質(zhì)編碼基因的密碼子組成及其使用頻率。

白額縱溝紐蟲線粒體基因組序列已提交到Gen－Bank，序列號(hào)為：JN234382。

表1 白額縱溝紐蟲線粒體基因組PCR擴(kuò)增引物Table 1 PCR primers used to amplify the complete mitochondrial genome of Lineus alborostratus

圖1 白額縱溝紐蟲線粒體DNA基因分布圖Fig.1 Circular representation of the mtDNA of Lineus alborostratus.

2 結(jié)果與討論

2.1 基因組構(gòu)成及結(jié)構(gòu)

白額縱溝紐蟲線粒體基因組為閉合環(huán)狀雙鏈DNA，全長(zhǎng)15 476 bp，與同屬的L.viridis（15 388 bp）相近。具有后生動(dòng)物線粒體基因組典型的基因組成，包括13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（nad1－6，nad4L，cox1－3，atp6，atp8，cytb），22個(gè)t RNA基因，2個(gè)r RNA基因和1個(gè)主要的非編碼區(qū)（見圖1）。除tRNA－Thr和tRNA－Pro外，其他基因均編碼在重鏈上。本種的基因排列順序與L.viridis［5］一致，大部分基因長(zhǎng)度差異較小，差異較大的是rrn L和非編碼區(qū)，分別為1241bp／1305bp和747bp／415bp。基因緊密，除前述主要非編碼區(qū)外只有總長(zhǎng)72 bp的21處基因間隔。在cox2和trn D、nad4L和nad 4基因之間分別存在2和7 bp的重疊（見表2），類似堿基重疊也見于其他紐蟲的線粒體基因組［4－6］。Boyce等［16］認(rèn)為基因間的堿基重疊促進(jìn)線粒體基因組小型化，而小型基因組復(fù)制所需時(shí)間短，具有一定的選擇優(yōu)勢(shì)。

表2 白額縱溝紐蟲線粒體基因組的基因分布Table 2 Location of genes in the mitochondrial genome of Lineus alborostratus

2.2 蛋白質(zhì)編碼基因

白額縱溝紐蟲的蛋白質(zhì)編碼基因中，nad4L與nad 4基因間存在7個(gè)堿基的重疊。這2個(gè)基因的重疊亦見于C.hongkongiensis，C.sp和L.viridis［4－6］，也常見于其他動(dòng)物的線粒體基因組［17］，可能nad4L／nad4間基因重疊具有一定的選擇優(yōu)勢(shì)［16］。13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因均以ATG為起始密碼子編碼在重鏈上（見表2，圖1）。除nad2、nad1和cytb基因使用不完全終止密碼子“T”外，其余的10個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因均以TAG或TAA終止。不完全終止密碼子（T或TA）在動(dòng)物線粒體DNA中常見［18］，通常在轉(zhuǎn)錄后的加工過程中加接多聚腺苷酸尾，形成完整TAA終止密碼子后終止翻譯［1，19］。

圖2 白額縱溝紐蟲nad4基因上的發(fā)卡結(jié)構(gòu)Fig.2 Hairpin structure in nad4 gene of Lineus alborostratus

所有蛋白質(zhì)編碼基因之間除nad4L／nad4，nad6／cytb，atp6／atp8和nad2／cox1基因外均以tRNA基因相連。這也是動(dòng)物線粒體基因組的典型特征，可能有助于t RNA三葉草結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確地將游離的氨基酸帶到核糖體上的特定位點(diǎn)并添加到新生肽鏈的末端［19］。值得注意的是，白額縱溝紐蟲的nad4基因（9 813～11 162 bp）上有一段37 bp的序列（10 052～10 088 bp）可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)（見圖2），其AT含量高達(dá)81.1%。蛋白質(zhì)編碼基因上的莖環(huán)結(jié)構(gòu)雖然也出現(xiàn)在其他紐蟲線粒體中，一般都出現(xiàn)在2個(gè)基因連接的地方，并被認(rèn)為是與多順反子的啟動(dòng)或轉(zhuǎn)錄有關(guān)［6］，這種出現(xiàn)在蛋白質(zhì)編碼基因內(nèi)部的二級(jí)結(jié)構(gòu)是否具有重要生物功能有待研究。

2.3 堿基組成和密碼子使用

堿基組成的偏好性常通過偏倚度（Skewness）來描述，該指標(biāo)能夠衡量A對(duì)T和G對(duì)C的相對(duì)數(shù)量，分別以（A%－T%）／（A%＋T%）和（G%－C%）／（G%＋C%）來計(jì)算［20］。白額縱溝紐蟲線粒體基因組各堿基百分含量為：T（41.2%）＞A（23.5%）＞G（22.8%）＞C（12.5%）（見表3），重鏈（H鏈）呈現(xiàn)出較強(qiáng)的T偏好（SkewAT＝－0.27）和較弱的C偏好（SkewGC＝0.29）。13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的A＋T含量為62.9%，略低于全序列的A＋T含量（64.7%），這種AT偏向性與其他紐蟲相似［4－7］。密碼子第三位點(diǎn)的A＋T含量高于第一位點(diǎn)和第二位點(diǎn)（見表3），反映了該位點(diǎn)在進(jìn)化過程中的選擇壓力較低，具有較高突變率［21］。所有基因中rrn L的A＋T堿基含量最高（73.2%）。

表3 白額縱溝紐蟲線粒體基因組堿基組成Table 3 Base compositions of the mitochondrial genome of Lineus alborostratus

白額縱溝紐蟲線粒體基因組的密碼子使用情況見表4，13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因共包含3 698個(gè)密碼子（終止子除外）。氨基酸出現(xiàn)頻率最高的是Leu（14.85%），其次為Phe（10.86%），兩者都屬于疏水氨基酸，這與線粒體基因組編碼的大部分蛋白質(zhì)是跨膜蛋白相適應(yīng)。蛋白質(zhì)編碼基因偏好使用富含T、G和A的密碼子，富含T的密碼子（三聯(lián)體密碼子中至少含有2個(gè)T）出現(xiàn)1 570次，占42.35%，富含G、A、C的密碼子（三聯(lián)體密碼子中至少含有2個(gè)G、A、C）出現(xiàn)頻率分別為12.99%、10.94%和4.94%。對(duì)于多數(shù)氨基酸，以T結(jié)尾的密碼子的出現(xiàn)頻率明顯高于其他同義密碼子，如Phe（TTT，9.92%；TTC，0.94%）、Ile（ATT，4.96%；ATC，0.49%）（見表4）。同義密碼子的偏好性被認(rèn)為與沉默位點(diǎn)的選擇有關(guān)，并且能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率［22－23］。由于同義密碼子并不改變最終的蛋白產(chǎn)物，所以對(duì)于那些頻繁被使用的密碼子的選擇性被認(rèn)為是很弱的［24］。

表4 白額縱溝紐蟲線粒體基因組中蛋白質(zhì)編碼基因的密碼子使用Table 4 Codon usage of protein－coding genes in the mitochondrial genome of Lineus alborostratus

＊終止密碼子Stop codons

2.4 轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和核糖體RNA

白額縱溝紐蟲線粒體基因組含有22個(gè)tRNA，長(zhǎng)度范圍為62～71 bp，通過t RNAScan－SE 1.21只找到21個(gè)t RNAs，另外的tRNA－Arg基因根據(jù)反密碼子，利用RNA structure 4.5軟件輔助人工預(yù)測(cè)得到（見圖3）。線粒體t RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中除正常的堿基配對(duì)外，還存在4處堿基錯(cuò)配，分別發(fā)生在2個(gè)tRNA－Leu的氨基酸接受臂和tRNA－Gln、tRNA－Trp的TΨC臂上。這種t RNA上的錯(cuò)配堿基在其他紐蟲線粒體基因組中均有發(fā)現(xiàn)［4－7］，這些錯(cuò)配可以通過轉(zhuǎn)錄后RNA編輯來修正，并不會(huì)影響t RNA對(duì)相應(yīng)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)功能［25－27］。另外還有大量的G－T配對(duì)，這在tRNA中是一種常見情況。

圖3 白額縱溝紐蟲線粒體基因組中預(yù)測(cè)的22個(gè)tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。Fig.3 Secondary structures predicted for 22 tRNAs in the mitochondrial genome of Lineus alborostratus

在其他紐蟲中有報(bào)道過缺失DHU臂的情況［5－6］，在白額縱溝紐蟲的tRNA中沒有出現(xiàn)。值得注意的是，tRNA－Cys的TΨC環(huán)只有2個(gè)T堿基，這2個(gè)T堿基可能就是欠完整的TΨC環(huán)。

白額縱溝紐蟲22個(gè)t RNA基因的反密碼子與L.viridis線粒體t RNA的反密碼子完全相同。與細(xì)首屬（Cephalothrix）的3種紐蟲及P.cf.peregrina相比，只有tRNA－Ser（AGN）的反密碼子有異。tRNA－Ser（AGN）的反密碼子在白額縱溝紐蟲和L.viridis中為TCT，在其它紐蟲中為GCT。

白額縱溝紐蟲線粒體基因組中含有2個(gè)r RNA基因（rrnS和rrn L），其長(zhǎng)度分別為835和1241 bp，以同一方向編碼在重鏈上，并由tRNA－Val分隔開（見圖1）。其中rrnS長(zhǎng)度大于P.cf.peregrina（776 bp），與C.hongkongiensis、C.sp.和L.viridis（分別為838、836、833 bp）接近，rrn L的長(zhǎng)度大于P.cf.pere－grina（1 093 bp），小于C.hongkongiensis、C.sp和L.viridis（分別為1 291，1 290和1 305 bp）［4－7］。

2.5 非編碼區(qū)

基因nad3和t RNA－Ser（AGN）之間的有一段長(zhǎng)度為747 bp的非編碼區(qū)（non－coding region，NC），占基因組全長(zhǎng)的4.83%，其AT含量為65.2%。在已測(cè)序紐蟲的線粒體DNA中均發(fā)現(xiàn)了類似的非編碼區(qū)，其中L.viridis非編碼區(qū)的位置與本種一致［5］，C.hongkongiensis和C.sp的主要非編碼區(qū)位于tRNA－Tyr和tRNA－Cys之間（除主要非編碼區(qū)外，這2種紐蟲還具另外2個(gè)大于100 bp的非編碼區(qū)）［4，6］，P.perigrina則在nad 4L／nad4和tRNA－Trp／tRNASer（AGN）之間分別具有長(zhǎng)度為101和114 bp的2段非編碼區(qū)［6］。主要非編碼區(qū)的長(zhǎng)度在幾種紐蟲間變化很大，從114 bp（P.perigrina）到885 bp（C.hongkongiensis）［4－6］。與同屬的L.viridis相比，白額縱溝紐蟲長(zhǎng)出332 bp（747 bp對(duì)415 bp）［5］。由于該區(qū)域所受的選擇壓力較小，與編碼區(qū)相比具有更高水平的長(zhǎng)度和位點(diǎn)多態(tài)性，不同動(dòng)物線粒體基因組DNA大小的差異主要是由這個(gè)區(qū)域長(zhǎng)度變化造成的［28］。

非編碼區(qū)在已報(bào)道的紐蟲都存在莖環(huán)結(jié)構(gòu)［4－6］，這類特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)在大多數(shù)后生動(dòng)物中被認(rèn)為是線粒體輕鏈復(fù)制起始位點(diǎn)［29－31］。但白額縱溝紐蟲非編碼區(qū)沒有檢測(cè)到類似結(jié)構(gòu)。紐蟲線粒體DNA非編碼區(qū)AT含量普遍高于基因組AT含量，如在C.hongkongiensis為83.8%［4］，在C.sp.一段389 bp的序列（非編碼區(qū)未完全測(cè)出）中更高達(dá)92.5%［6］。因此，此非編碼區(qū)也稱為AT富含區(qū)［32］。白額縱溝紐蟲非編碼區(qū)65.2%的AT含量在已測(cè)紐蟲中是最低的。此外，在白額縱溝紐蟲的非編碼區(qū)還發(fā)現(xiàn)了一些短的重復(fù)單元，如ATTTTTTA、AAAAAAT各有3個(gè)重復(fù)，GGGGG有4個(gè)重復(fù)。一般來說線粒體重復(fù)單元長(zhǎng)度一般由1～數(shù)百bp不等，重復(fù)數(shù)也可以從2個(gè)到幾百不等，其產(chǎn)生機(jī)制一般認(rèn)為是由于鏈的滑動(dòng)錯(cuò)配所導(dǎo)致［33－34］。

除了這個(gè)主要的非編碼區(qū)外，白額縱溝紐蟲線粒體基因組中還存在21處長(zhǎng)度為1～12 bp的核苷酸插入?yún)^(qū)，總長(zhǎng)72 bp，2處12 bp間隔分別位于cox1和tRNA－Trp、nad4和tRNA－His之間。相比L.viridis總長(zhǎng)248 bp的24處核苷酸插入［5］，白額縱溝紐蟲的插入核苷酸明顯較少。

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