倪永慶，邢 婧，林聽聽，戰(zhàn)文斌

（中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003）

血細(xì)胞是貝類免疫防御系統(tǒng)重要的組成部分，可參與炎癥、傷口修復(fù)、呼吸爆發(fā)、吞噬和包囊等作用［1］。1960－1970年代，研究者們主要對(duì)貝類血細(xì)胞分類和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究；1980年代以后，貝類血細(xì)胞的免疫防御功能備受關(guān)注［2－4］。近年來，貝類血細(xì)胞的發(fā)生和分化開始成為研究熱點(diǎn)，研究者們多采用單克隆抗體對(duì)貝類血細(xì)胞進(jìn)行組織定位，在應(yīng)用抗血細(xì)胞單克隆抗體對(duì)紫貽貝（Mytilus edulis）各期胚胎幼蟲研究中發(fā)現(xiàn)在第1～4天的幼蟲出現(xiàn)了血細(xì)胞［5］；在牡蠣（Ostrea edulis）中應(yīng)用抗顆粒細(xì)胞單克隆抗體發(fā)現(xiàn)了其顆粒細(xì)胞出現(xiàn)在第30～32天牡蠣幼蟲鰓的結(jié)締組織和上皮細(xì)胞之間［6］。研究組在制備出抗櫛孔扇貝（Chlamys farreri）血細(xì)胞的單克隆抗體的基礎(chǔ)上，應(yīng)用單克隆抗體定位了櫛孔扇貝稚貝的造血組織［7］；并發(fā)現(xiàn)血細(xì)胞出現(xiàn)在D形幼蟲期，數(shù)量較少，分布僅局限于消化器官周圍［8］。相比于D形幼蟲，殼頂幼蟲的細(xì)胞與組織分化快，消化器官、循環(huán)系統(tǒng)等發(fā)育更加完善，功能增強(qiáng)。本文采用半薄切片的組織化學(xué)染色法和單克隆抗體的免疫組化方法、免疫電鏡方法，研究櫛孔扇貝D形幼蟲期后的殼頂幼蟲血細(xì)胞的形態(tài)特征與分布特點(diǎn)，以期為研究和闡明扇貝各發(fā)育階段血細(xì)胞的發(fā)生與分化積累資料。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

櫛孔扇貝殼頂幼蟲采集于山東尋山水產(chǎn)集團(tuán)海珍品綜合養(yǎng)殖場(chǎng)，經(jīng)顯微鏡測(cè)量其殼長(zhǎng)×殼高為（125～156）μm×（105～138）μm［9］。采集的殼頂幼蟲樣品經(jīng)2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，經(jīng)梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，聚合，超薄切片機(jī)連續(xù)切片。半薄切片厚度為2μm，脫去樹脂［10］，用于愛氏蘇木精與曙紅染色（H＆E染色）與免疫組化；超薄切片厚度為70 nm，用于免疫電鏡。

免疫組化所用的第一抗體為四株抗櫛孔扇貝血細(xì)胞單克隆抗體（1E7，1F12，2C6，2 H5）的混合抗體，由本實(shí)驗(yàn)室研制［11］。生物素化馬抗小鼠IgG（H＋L）、堿性磷酸酶標(biāo)記鏈親和素、堿性磷酸酶底物AP－Red試劑盒購自北京中杉金橋生物公司，膠體金（SPA）標(biāo)記羊抗小鼠IgG購自SIGMA公司，金顆粒直徑為10 nm。牛血清蛋白（BSA）購自AMRESCO公司。鋨酸及環(huán)氧樹脂（Epon－812）購自SERVA公司。

1.2 方法

1.2.1 H＆E染色與免疫組化 將半薄切片置于愛氏蘇木精染液內(nèi)，60℃染色1 h，蒸餾水沖洗1 min，1%曙紅染10 min，蒸餾水沖洗，50%緩沖甘油封片，顯微鏡（OLYMPUS BX－51）觀察，拍照。用于免疫組化的半薄切片，首先加0.3%乙酸室溫孵育10 min，以抑制內(nèi)源酶活性，然后用含0.1%Tween－20的0.01 mol·L－1磷酸鹽緩沖液（PBST，p H＝7.4）浸洗5 min；加5%牛血清白蛋白孵育室溫封閉30 min；加抗櫛孔扇貝血細(xì)胞混合單克隆抗體為第一抗體，37℃孵育1 h，PBST浸洗3次，每次5 min；然后加生物素化馬抗小鼠IgG（稀釋比例1∶600），37℃孵育45 min，PBST浸洗3次，每次5 min；再加堿性磷酸酶標(biāo)記鏈親和素（稀釋比例1∶500），37℃孵育45 min，PBST浸洗3次，每次5 min。最后，以堿性磷酸酶底物AP－Red試劑盒底物發(fā)色5 min，蒸餾水沖洗，蘇木精襯染3 min，0.1%HCl酒精分色，蒸餾水沖洗，藍(lán)化，伊文思藍(lán)再次襯染2 min，蒸餾水沖洗，50%緩沖甘油封片，顯微鏡觀察，拍照。陰性對(duì)照以骨髓瘤細(xì)胞（P3U1）培養(yǎng)液上清液代替混合抗體作為第一抗體。

1.2.2 免疫電鏡 超薄切片經(jīng)1%H2O2處理30 min以暴露抗原，之后以超純水清洗；5%BSA封閉30 min，加入混合抗體為第一抗體，37℃孵育1 h，PBST浸洗3次，每次5 min；加入膠體金標(biāo)記羊抗小鼠IgG（稀釋比例1∶100）為第二抗體，37℃孵育1 h，PBST浸洗3次，每次5 min，再以超純水浸洗3次，每次3 min，自然晾干；經(jīng)5%醋酸鈾染20 min，超純水洗3次，每次3 min；枸櫞酸鉛染色15 min，超純水充分洗凈；干燥后在JEM－1200EX型透射電子顯微鏡下觀察，拍照。陰性對(duì)照以P3U1代替混合單抗作為一抗。

2 結(jié)果

2.1 H＆E染色觀察

半薄切片H＆E染色觀察發(fā)現(xiàn)，櫛孔扇貝殼頂幼蟲組織器官分化清晰，界限明顯。外緣為外套膜，內(nèi)臟團(tuán)包括面盤、口、消化道、胃、消化腺、足等（見圖1A）。面盤收縮于外套膜內(nèi)，表面具有密集的纖毛?？谖挥诿姹P一側(cè)，連接著狹隘而短的食道。胃與食道相連，為膨大的囊狀，約占幼蟲體積的1／3，可見胃腔內(nèi)食物。消化腺圍繞在胃和消化道附近。足位于內(nèi)臟團(tuán)的一側(cè)，呈橢圓形。幼蟲體內(nèi)細(xì)胞以成簇或游離狀分布，呈圓形或橢圓形，直徑為3～5μm，H＆E染色細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)呈暗紅色（見圖1B）。游離的細(xì)胞數(shù)目少，成簇分布的細(xì)胞數(shù)量多，大小不一，聚集分布于外套膜、面盤、食道、消化腺、胃等處。

圖1 櫛孔扇貝（Chlamys farreri）殼頂幼蟲的H＆E染色結(jié)果Fig.1 H＆E staining observation of umbolarvae in Chlamys farreri

2.2 免疫組化觀察

半薄切片免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性信號(hào)（紅色沉淀）出現(xiàn)在殼頂幼蟲的外套膜、面盤、食道、消化腺、胃等組織器官內(nèi)的細(xì)胞中，陽性細(xì)胞清晰可辨，直徑為3～5μm，細(xì)胞質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，說明該時(shí)期幼蟲體內(nèi)血細(xì)胞分布廣泛（見圖2A）。根據(jù)陽性細(xì)胞的分布可見，外套膜組織內(nèi)的血細(xì)胞散在分布，呈梭形或橢圓形；在面盤頂部與食道附近有少量游離血細(xì)胞的存在；在面盤基部、消化腺和胃的周圍血細(xì)胞數(shù)量多，大小不一，形態(tài)多樣，并且相互聚集成簇。陰性對(duì)照無陽性信號(hào)出現(xiàn)（見圖2B）。本結(jié)果與H＆E染色觀察的細(xì)胞分布特點(diǎn)相似，證實(shí)所觀察的細(xì)胞主要為血細(xì)胞。

2.3 免疫電鏡觀察

免疫電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膠體金顆粒結(jié)合的血細(xì)胞分布在殼頂幼蟲的外套膜、面盤、食道、消化腺、胃等組織器官內(nèi)。血細(xì)胞直徑3～5μm，呈不規(guī)則狀。細(xì)胞核多位于細(xì)胞一側(cè)，常染色質(zhì)電子密度低，異染色質(zhì)電子密度高，分布于核周緣和常染色質(zhì)之間。細(xì)胞質(zhì)電子密度相對(duì)低，可見線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器以及空泡。不同組織中，血細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)略有差異：消化腺組織內(nèi)的血細(xì)胞，密集而擠壓，細(xì)胞邊緣不規(guī)則，細(xì)胞核呈腎形或不規(guī)則狀，胞質(zhì)內(nèi)有多個(gè)線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，核質(zhì)比高（見圖3A）。面盤組織內(nèi)的血細(xì)胞，呈多邊形，細(xì)胞核橢圓形，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較少，僅有少量線粒體，核質(zhì)比低（見圖3B）；在血細(xì)胞內(nèi)均可見大小一致、電子密度高而清晰的圓形膠體金顆粒，膠體金顆粒多呈點(diǎn)狀分布在血細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)以及核質(zhì)交界區(qū)域，在細(xì)胞核與細(xì)胞膜也有少量膠體金顆粒的分布。

3 討論

本文通過半薄切片H＆E染色法和單克隆抗體的免疫組化、免疫電鏡法定位櫛孔扇貝殼頂幼蟲的血細(xì)胞，觀察血細(xì)胞的分布特點(diǎn)。結(jié)果表明，櫛孔扇貝殼頂幼蟲外套膜、面盤、口、食道、消化腺、胃、足等組織器官分化清晰；殼頂幼蟲的外套膜、面盤、食道、消化腺、胃等組織器官內(nèi)及周圍廣泛分布著血細(xì)胞，其中面盤、消化腺、胃等處有大量血細(xì)胞聚集成簇。

研究組前期應(yīng)用單克隆抗體的免疫組化方法研究櫛孔扇貝血細(xì)胞的胚胎發(fā)生時(shí)相，在囊胚期、原腸胚期、擔(dān)輪幼蟲期均未出現(xiàn)陽性信號(hào)，陽性信號(hào)出現(xiàn)于D形幼蟲期，但該時(shí)期血細(xì)胞數(shù)量較少，分布也比較局限，僅分布于幼蟲消化組織器官周圍，血細(xì)胞內(nèi)部形態(tài)不易分辨［8］。與D形幼蟲相比，殼頂幼蟲的陽性信號(hào)明顯增強(qiáng)，分布位點(diǎn)也明顯增多，說明大量血細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)在殼頂幼蟲體內(nèi)，并且廣泛分布于外套膜、面盤、食道、消化腺、胃等器官，其形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰可辨，胞質(zhì)內(nèi)含有多個(gè)線粒體。血細(xì)胞在消化食物、吞噬異物和降解廢物過程中需要大量能量，可推測(cè)血細(xì)胞參與幼蟲營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、消化和運(yùn)輸?shù)裙δ堋?/p>

在組織形態(tài)學(xué)研究方面，多采用石蠟切片，但由于本實(shí)驗(yàn)中櫛孔扇貝（殼頂幼蟲）個(gè)體較小，殼長(zhǎng)僅為125～156μm，前期工作用石蠟包埋切片厚度在5～7μm之間，染色后觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞重疊多，無法清晰地觀察到殼頂幼蟲的組織結(jié)構(gòu)和血細(xì)胞的內(nèi)部形態(tài)。半薄切片是經(jīng)環(huán)氧樹脂包埋，厚度在1～2μm的薄片，在高倍鏡下視野清楚，細(xì)胞重疊少，結(jié)構(gòu)清晰度高，細(xì)胞界限分明，而且半薄切片是電鏡超薄切片技術(shù)中一種有效的定位方法。但該方法不能定性地研究血細(xì)胞除分布以外的其它特點(diǎn)，而且僅僅用H＆E染色觀察不足以證明所觀察到的細(xì)胞為血細(xì)胞，這需要借助抗櫛孔扇貝血細(xì)胞的單克隆抗體，在幼蟲中原位定位血細(xì)胞，以獲得充足的證據(jù)。因此，本研究采用半薄切片H＆E染色法和免疫組化方法觀察殼頂幼蟲的組織結(jié)構(gòu)，并原位定位血細(xì)胞的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)殼頂幼蟲已經(jīng)分化出界限清晰的組織器官，并且發(fā)現(xiàn)與消化功能相關(guān)的組織器官內(nèi)及周圍廣泛分布著血細(xì)胞。同時(shí)，本研究采用免疫電鏡方法進(jìn)一步定位觀察幼蟲體內(nèi)各組織中血細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組織內(nèi)血細(xì)胞形狀不規(guī)則，直徑為3～5μm，細(xì)胞核多位于細(xì)胞的一側(cè)，多為圓形或橢圓形，常染色質(zhì)電子密度低，異染色質(zhì)電子密度高，分布于核周緣和常染色質(zhì)之間，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器和空泡。本研究采用半薄切片H＆E染色、免疫組化和超薄切片免疫電鏡方法互相對(duì)照，更加詳盡地解析殼頂幼蟲組織結(jié)構(gòu)與血細(xì)胞分布的特點(diǎn)。

免疫組化結(jié)果基本印證了半薄切片H＆E染色結(jié)果中血細(xì)胞的分布特點(diǎn)，但略有不同，免疫組化結(jié)果并非所有的血細(xì)胞都顯示為陽性。究其原因，第一種可能是因?yàn)榻?jīng)環(huán)氧樹脂包埋，高溫聚合、脫樹脂等處理，雖然保證了樣品的形態(tài)結(jié)構(gòu)，但高溫聚合對(duì)細(xì)胞的影響較大，容易出現(xiàn)細(xì)胞漿破壞、核破裂等現(xiàn)象，不可避免使樣品抗原決定簇受到破壞；第二種可能是因?yàn)闄笨咨蓉愌?xì)胞的單克隆抗體是抗成熟血細(xì)胞某一特定抗原決定簇，而殼頂幼蟲組織中血細(xì)胞處于發(fā)生、分化和未成熟階段，其抗原決定簇的類型和數(shù)量與成熟血細(xì)胞稍有差異；第三種可能是因?yàn)榍衅慕嵌然蚝穸炔⑽幢┞镀湎鄳?yīng)的抗原決定簇所致。

有關(guān)櫛孔扇貝血細(xì)胞的研究報(bào)道都集中于成體，但關(guān)于幼蟲的研究較少。研究組前期對(duì)櫛孔扇貝的成貝血細(xì)胞形態(tài)及其分類作了初步研究，并且初步定位了櫛孔扇貝稚貝的造血組織［12，7］。本研究未發(fā)現(xiàn)到櫛孔扇貝殼頂幼蟲中顆粒血細(xì)胞和透明血細(xì)胞的類型分化，以及類似稚貝造血組織的結(jié)構(gòu)。今后可進(jìn)一步通過不同類型血細(xì)胞的單克隆抗體對(duì)不同時(shí)期幼蟲血細(xì)胞的發(fā)生、分化和成熟過程進(jìn)行深入地研究。

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