曾曉起，張文峰，高天翔

（中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東青島266003）

刻肋海膽屬（Temnopleurus）隸屬于海膽綱（Echinoidea），拱齒目（Camarodonta），刻肋海膽科（Temnopleuridae）［1］?？汤吆Ｄ憣俪Ｒ娪?個(gè)種：哈氏刻肋海膽（Temnopleurus hardwickii）、細(xì)雕刻肋海膽（T.toreumaticus）、芮氏刻肋海膽（T.reevesii）、T.alexandri和T.michaelseni。哈氏刻肋海膽為中國、韓國和日本沿岸特有種，在我國黃、渤海沿岸很常見，并向南分布到舟山群島和臺(tái)灣海峽；細(xì)雕刻肋海膽分布于非洲東海岸、波斯灣、大洋洲東海岸以及東亞，為我國南北各海區(qū)的廣分布種；芮氏刻肋海膽廣泛分布于印度－西太平洋沿岸，為南海和東海的常見種［2］；T.alexandri和T.michaelseni主要分布于大洋洲東海岸。目前國內(nèi)外對(duì)刻肋海膽屬生物學(xué)方面的研究主要集中在發(fā)育生物學(xué)和形態(tài)學(xué)［3－5］，而對(duì)我國刻肋海膽屬系統(tǒng)發(fā)育學(xué)方面的研究尚未見報(bào)道。

線粒體DNA（mt DNA）由于其具有遵循嚴(yán)格的母系遺傳、幾乎無重組、結(jié)構(gòu)簡單以及在不同的區(qū)域進(jìn)化速度存在差異等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為種群遺傳學(xué)和分子系統(tǒng)發(fā)育研究的重要標(biāo)記［6－8］。16S r RNA基因是非編碼蛋白質(zhì)基因，其大部分區(qū)域發(fā)生的突變?yōu)橹行酝蛔?，加之其進(jìn)化速度適中，因此常被應(yīng)用于不同階元物種的系統(tǒng)進(jìn)化和分類研究［9］。劉曉慧等［10］對(duì)我國5種經(jīng)濟(jì)海膽（光棘球海膽、中間球海膽、馬糞海膽，海刺猬和紫海膽）線粒體16S r RNA基因片段的序列進(jìn)行了分析，并得到了較為可信的種間遺傳距離和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。細(xì)胞色素氧化酶I（Cytochrome oxidase subunit I，COI）基因是線粒體氧化呼吸鏈的重要成員，其序列已被應(yīng)用于貝類、海參等無脊椎動(dòng)物的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究［11－12］。本研究對(duì)我國分布的3種刻肋海膽（哈氏刻肋海膽、細(xì)雕刻肋海膽、芮氏刻肋海膽）的線粒體16S r RNA和COI基因部分序列進(jìn)行比較分析；并進(jìn)一步探討了刻肋海膽屬內(nèi)5種不同種海膽的遺傳分化程度以及種間系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，以期為我國海膽的種質(zhì)鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用哈氏刻肋海膽（縮寫為HS）樣品于2010年10～11月分別采自遼寧大連黑石礁（1個(gè)）、山東青島大公島（2個(gè)）和浙江溫州南麂列島（4個(gè)）；細(xì)雕刻肋海膽（縮寫為XD）樣品于2010年10～11月分別采自遼寧大連黑石礁（3個(gè)）、浙江溫州南麂列島（1個(gè)）和福建泉州崇武（2個(gè)）；芮氏刻肋海膽（縮寫為RS）于2010年10月采自福建漳州東山（2個(gè)）。采集后，用95%酒精固定，保存?zhèn)溆?。T.alexandri、T.michaelseni和外群雜色角孔海膽（Salmacis sphaeroides）的序列信息來自GenBank（見表1）。

表1 本研究所用海膽基本信息Table 1 List of sea urchins in this study

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 取海膽樣品的齒間肌，采用標(biāo)準(zhǔn)的酚－氯仿法［13］提取基因組DNA，將乙醇沉淀后的基因組DNA溶解于100μL TE溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 目的片段的PCR擴(kuò)增和測序

用于擴(kuò)增線粒體16S r RNA片段的引物［12］為：

16Sar：5′－CGCCTGTTTAACAAAAACAT－3′，

16Sbr：5′－CCGGTCTGAACTCAGATCATG－3′。

用于擴(kuò)增線粒體COI片段的引物［14］為：

COIef：5′－ATAATGATAGGAGGGTTTGG－3′，

COIer：5′－GCTCGTGTGTCTACGTCCAT－3′。

16S r RNA和COI 2個(gè)基因片段的PCR過程，分別參照李穎［12］和Kerry L.Howell［14］的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行。以上反應(yīng)均設(shè)陰性對(duì)照以排除DNA污染的情況。取2μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（U＝5 V／cm）。

用UNIQ－10柱式DNA膠回收試劑盒（上海華舜）進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收純化。純化后的產(chǎn)物送上海桑尼公司進(jìn)行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用DNAStar軟件（DNASTAR，Inc）中的Seq－Man軟件對(duì)哈氏刻肋海膽、細(xì)雕刻肋海膽和芮氏刻肋海膽的正反鏈序列進(jìn)行組裝，分別得到16S r RNA和COI基因片段的部分序列。用Clustal X對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，用MEGA4［15］軟件統(tǒng)計(jì)3種海膽的變異位點(diǎn)（variable sites）和簡約信息位點(diǎn)（parsimony infoanative site）數(shù)，轉(zhuǎn)換（Ts）顛換（Tv）位點(diǎn)數(shù)，再計(jì)算轉(zhuǎn)換顛換比率（Ts／Tv），計(jì)算3種海膽的單倍型數(shù)，并將單倍型序列提交到Genbank。

結(jié)合從Gen Bank中獲得的刻肋海膽屬另外2種海膽（Temnopleurus alexandri，Temnopleurus michaels－eni）的16S r RNA和COI基因片段序列，基于Kimura－2－parameter模型計(jì)算這5種海膽的種間平均遺傳距離。用PAUP4.0［16］和Modeltest 3.7［17］軟件對(duì)聯(lián)配的同源序列進(jìn)行核苷酸替代模型篩選，得到2個(gè)目的片段堿基替代最適模型及其相關(guān)參數(shù)。使用MEGA4和PAUP4.0軟件，應(yīng)用距離法（NJ）、最大簡約法（MP）、最大似然法（ML），分別構(gòu)建5種海膽16S r RNA和COI 2個(gè)基因片段的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 基因片段序列多樣性

16S r RNA基因片段：3種海膽共存在9個(gè)插入或缺失位點(diǎn)，89個(gè)變異位點(diǎn)，包含54個(gè)簡約信息位點(diǎn)。發(fā)生堿基轉(zhuǎn)換和顛換位點(diǎn)數(shù)平均為24和17個(gè)，轉(zhuǎn)換／顛換平均值為1.4（見表2）。哈氏刻肋海膽6個(gè)個(gè)體共有3種單倍型，分別是：HSA（HS1、HS4、HS6、HS7）、HSB（HS2）、HSC（HS5），所對(duì)應(yīng)的GenBank登錄號(hào)是：JN128612～JN128614；細(xì)雕刻肋海膽6個(gè)個(gè)體共有4種單倍型，分別是：XDA（XD1）、XDB（XD2、XD4、XD6）、XDC（XD3）、XDD（XD5），所對(duì)應(yīng)的Gen－Bank登錄號(hào)是：JN128615～JN128618；芮氏刻肋海膽2個(gè)個(gè)體共有2種單倍型，分別是：RSA（RS1）、RSB（RS2），所對(duì)應(yīng)的GenBank登錄號(hào)是：JQ065692和JQ065693。

COI基因片段：3種海膽無插入或缺失位點(diǎn)，157個(gè)變異位點(diǎn)，包含155個(gè)簡約信息位點(diǎn)。發(fā)生堿基轉(zhuǎn)換和顛換位點(diǎn)數(shù)平均為38和32個(gè)，轉(zhuǎn)換／顛換平均值為1.2（見表2）。哈氏刻肋海膽7個(gè)個(gè)體共有6種單倍型，分別是：HSCA（HS1）、HSCB（HS2）、HSCC（HS3、HS6）、HSCD（HS4）、HSCE（HS5）、HSCF（HS7），所對(duì)應(yīng)的GenBank登錄號(hào)是：JN128619～JN128624；細(xì)雕刻肋海膽5個(gè)個(gè)體共有5種單倍型，分別是：XDCA（XD1）、XDCB（XD2）、XDCC（XD 4）、XDCD（XD5）、XDCE（XD6），所對(duì)應(yīng)的GenBank登錄號(hào)是：JN128625～JN128629；芮氏刻肋海膽2個(gè)個(gè)體共有2種單倍型，分別是：RSCA（RS1）、RSCB（RS2），所對(duì)應(yīng)的GenBank登錄號(hào)是：JN128630和JN128631。

表2 3種刻肋海膽16S r RNA和COI基因片段序列多樣性Table 2 Sequence variability for 16S rRNA and COI of 3 species of genus Temnopleurus

2.2 遺傳分化

結(jié)合在GenBank中獲得刻肋海膽屬另外2種海膽的16S r RNA和COI片段序列，用Mega4.0軟件，基于Kimura－2－parameter模型計(jì)算得到5種海膽種間平均遺傳距離（見表3）。從結(jié)果來看在16S r RNA水平上各種間的遺傳距離在0.078～0.185之間，在COI水平上各種間的遺傳距離在0.158～0.206之間。在16S r RNA和COI 2個(gè)基因片段上，均表現(xiàn)為芮氏刻肋海膽和T.michaelseni遺傳距離最小，分別為0.078和0.158。16S r RNA基因片段上，T.alexandri和芮氏刻肋海膽遺傳距離最大，為0.185；COI基因片段上，哈氏刻肋海膽和芮氏刻肋海膽遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.206（見表3）。

表3 5種海膽種間平均K2－P遺傳距離（左下角：16S r RNA，右上角：COI）Table 3 Average K2－P genetic distance based on 16S rRNA region（below diagonal）and COI region（above diagonal）of 5 different species genus Temnopleurus

圖1 基于16S r RNA基因片段構(gòu)建NJ、MP和ML系統(tǒng)進(jìn)化樹（后驗(yàn)概率高于50%標(biāo)注在分支上）Fig.1 Phylogenetic tree of 5 species constructed with neighbor－joining，maximum parsimony and maximum likelihood method based on 16S r RNA（numbers on the tree representposterior probability values）

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于5種海膽16S r RNA和COI基因片段序列的數(shù)據(jù)，用MEGA4和PAUP4.0軟件，以雜色角孔海膽為外類群，應(yīng)用距離法（NJ）、最大簡約法（MP）、最大似然法（ML）分別重建了2個(gè)片段各種單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹，得到的系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致（見圖1，2）。在2個(gè)基因片段上哈氏刻肋海膽和細(xì)雕刻肋海膽均先聚為一支，再與T.alexandri聚類；芮氏刻肋海膽和T.michaelseni聚為一支。

圖2 基于COI基因片段構(gòu)建NL、MP和ML系統(tǒng)進(jìn)化樹（后驗(yàn)概率高于50%標(biāo)注在分支上）Fig.2 Phylogenetic tree of 5 species constructed with neighbor－joining，maximum parsimony and maximum likelihood method based on COI（numbers on the tree representposterior probability values）

3 討論

張文峰等［18］對(duì)哈氏刻肋海膽、細(xì)雕刻肋海膽和芮氏刻肋海膽，3種海膽的形態(tài)學(xué)進(jìn)行了定量研究。其中聚類分析研究結(jié)果為哈氏刻肋海膽和細(xì)雕刻肋海膽先聚為一支，再與芮氏刻肋海膽聚類。這一形態(tài)學(xué)結(jié)果和本研究中利用16Sr RNA和COI基因片段進(jìn)行的聚類分析結(jié)果是一致的。

由表2可以看出，16Sr RNA和COI基因片段的變異位點(diǎn)數(shù)存在差異。mt DNA中不同區(qū)域的核苷酸突變速率不同，或不同的基因片段受到的選擇壓力不同，是造成線粒體不同基因片段變異存在差異的主要原因［19］。

McCartney等［20］以上新世中期（約350萬年前）巴拿馬地峽（Isthmus of Panama）首次開放作為分子鐘標(biāo)準(zhǔn)，估算出長海膽屬內(nèi)COI基因核苷酸分歧速率為3.49%／百萬年。Jeffery［21］認(rèn)為長海膽科和刻肋海膽科親緣關(guān)系很近，可以將長海膽屬的COI基因核苷酸分歧速率應(yīng)用于刻肋海膽屬。因此，本研究以3.49%／百萬年的核苷酸分歧速率應(yīng)用于5種海膽的COI基因片段。推斷，哈氏刻肋海膽先與芮氏刻肋海膽在約590萬年前分化，然后再與T.michaelseni在約570萬年前分化，最后與細(xì)雕刻肋海膽和T.alexandri在約500萬年前分化。分化事件主要發(fā)生在中新世晚期（Late Miocene）至上新世早期（Early Pliocene）。這與Hewitt認(rèn)為物種的形成過程主要發(fā)生在上新世和更新世［22］是一致的。

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