陳遠(yuǎn)欽 邱建龍 張永輝 陳婷婷 鄭素瓊

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是嚴(yán)重威脅人類生命的惡性腫瘤之一[1]，在中國的發(fā)病率居高不下，在惡性腫瘤中位居第2位。HCC的組織形態(tài)復(fù)雜多變，一些高分化腫瘤與正常肝組織或良性肝腫瘤難以鑒別，低分化腫瘤需與轉(zhuǎn)移癌鑒別，因此經(jīng)常需要免疫組化來輔助診斷。以往較常用于HCC診斷的抗體有AFP、CD34及CK8等，但應(yīng)用價(jià)值相對(duì)有限。20世紀(jì)90年代以來，肝細(xì)胞單克隆抗體Hep-Par-1及磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。Hep-Par-1在判斷腫瘤是否為肝細(xì)胞來源方面具有重要的診斷價(jià)值，被推薦為診斷HCC的一線抗體之一[2]。GPC3是近年來較熱門的1種用于肝細(xì)胞癌診斷的標(biāo)記物，因其敏感性好、特異性高，被認(rèn)為可能是1種新型癌胚因子[3]。本文應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，對(duì)64例HCC分別進(jìn)行GPC3及Hep-Par-1抗體標(biāo)記，探討其在HCC診斷與鑒別診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機(jī)抽取解放軍180醫(yī)院病理科1998～2011年手術(shù)切除的肝癌組織標(biāo)本64例。年齡22～79歲，中位年齡55歲，其中男性56例，女性8例。按照2008版WHO組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)將HCC分為高分化6例、中分化28例、低分化30例。另選取28例癌旁肝組織、2例HA、6例FNH、12例肝內(nèi)ICC、11例肝內(nèi)MAC等作為對(duì)照研究。選取病例均經(jīng)病理檢查確診。

1.2 方法

所有選取標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋、制片。免疫組織化學(xué)采用EliVision法(產(chǎn)品編號(hào)：KIT-9903)，人抗Glypican-3(GPC3)、Hep-Par-1等試劑均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。操作嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判定

GPC3陽性定位于胞質(zhì)或胞膜，Hep陽性定位于胞質(zhì)。染色程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野，根據(jù)每個(gè)視野中陽性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分：陽性細(xì)胞數(shù)< 5%為0分，5%～10%為1分，11%～50%為2分，>50%為3分。免疫組化結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：上述兩項(xiàng)得分相乘，0分為"-"，1～2分為"+"，3～5分為"++"，6分以上為"+++"。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 GPC3表達(dá)情況

64例HCC中58例胞質(zhì)/胞膜呈陽性表達(dá)，GPC3表達(dá)率為91%(58/64)，其中75%(48/64)呈強(qiáng)陽性表達(dá)(+++)，在28例癌旁肝組織、2例HA、6例FNH、12例肝內(nèi)ICC、11例肝內(nèi)MAC中均無表達(dá)(表1)。GPC3在HCC中表達(dá)率顯著高于其他非HCC腫瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 Hep-Par-1表達(dá)情況

64例HCC中52例胞質(zhì)呈陽性表達(dá)，Hep-Par-1表達(dá)率為81%(52/64)；28例癌旁肝組織、2例HA及6例FNH中Hep-Par-1表達(dá)率為100%；1例MAC呈陽性表達(dá)，表達(dá)率為9%(1/11)；12例ICC中無表達(dá)(表1)。肝細(xì)胞來源的腫瘤組織中Hep-Par-1表達(dá)率顯著高于其他腫瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 GPC3和Hep-Par-1在不同組織中的表達(dá)情況(例，%)

2.3 GPC3與Hep-Par-1表達(dá)的相關(guān)性

GPC3和Hep-Par-1均與HCC組織學(xué)分化相關(guān)，腫瘤組織學(xué)分化越低，GPC3表達(dá)率越高，表達(dá)強(qiáng)度越強(qiáng)；低分化HCC中Hep-Par-1表達(dá)率明顯低于高分化HCC，并且腫瘤組織學(xué)分化越低，其表達(dá)強(qiáng)度越弱(表2)；GPC3表達(dá)與Hep-Par-1表達(dá)無明顯相關(guān)性。

表2 GPC3和Hep-Par-1表達(dá)與HCC組織學(xué)分化的相關(guān)性(例，%)

3 討論

1996年P(guān)ilia等[4]首先描述了磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3,GPC3)，把它列為硫酸類肝素糖蛋白聚糖家族中的一員。GPC3通過糖基磷脂酰肌醇(GP I)結(jié)合于細(xì)胞表面[5]。研究表明，GPC3通過增強(qiáng)自分泌或旁分泌Wnt基因表達(dá)信號(hào)來刺激體內(nèi)和體外HCC腫瘤細(xì)胞生長，在腫瘤的惡性轉(zhuǎn)變和持續(xù)增殖中發(fā)揮著特殊作用[6]。GPC3在人體胚胎期的胎盤、胚肝、胚肺和胚腎中都有表達(dá)，成人后喪失表達(dá)。1997年Hsu等[7]首次報(bào)道了GPC3在HCC中的表達(dá)情況，在154例HCC組織中，74.8%檢測到GPC3mRNA，而在正常肝和肝炎組織中只有3.2%檢測到GPC3基因。Coston等[8]通過免疫組織化學(xué)檢測了107例HCC，其中94例(84%)GPC3呈陽性表達(dá)，而在225例非HCC的癌癥中只有7例(3%)發(fā)現(xiàn)有GPC3陽性染色。GPC3在肝外腫瘤鮮見表達(dá)，主要見于肺鱗癌、卵巢癌、乳腺癌及部分生殖細(xì)胞腫瘤等[9,10]。在本組HCC病例研究中，GPC3陽性率達(dá)91%(58/64)，略高于文獻(xiàn)報(bào)道。在28例癌旁肝組織、2例HA、6例FNH、12例肝內(nèi)ICC、11例肝內(nèi)MAC均無表達(dá)，故特異性達(dá)100%。GPC3在本組HCC中具有高的敏感性及特異性特點(diǎn)，與文獻(xiàn)報(bào)道的基本符合，表明在HCC與其他肝臟常見惡性腫瘤的鑒別診斷中具有重要應(yīng)用價(jià)值。本組病例癌旁肝組織中未有表達(dá)，與有關(guān)文獻(xiàn)不相一致，可能與研究病例較少或者結(jié)果判讀不同有關(guān)。GPC3在HCC中多數(shù)為彌漫強(qiáng)陽性表達(dá)(評(píng)分2分以上占95%)，故在肝針吸活檢小標(biāo)本中有較高的應(yīng)用價(jià)值。另外，隨著組織學(xué)分化越低，GPC3表達(dá)率越高，表達(dá)強(qiáng)度越強(qiáng)，然而，葉玉清等[11]研究顯示，GPC3在肝未分化癌中表達(dá)缺失，提示GPC3可能在腫瘤進(jìn)展中起特殊作用。

Hep-Par-1是Wennerberg等[12]在1993年以石蠟包埋的肝組織作為抗原克隆出的一株新的單克隆抗體，是1種線粒體相關(guān)抗原。Amarapurkar等[13]研究顯示Hep-Par-1在鑒別HCC、肝內(nèi)ICC、MAC中發(fā)揮著非常重要作用，其敏感性及特異性分別為89%及96%。Hep-Par-1在肝外的表達(dá)主要見于消化道腫瘤中，國內(nèi)周新木等[14]通過免疫組化發(fā)現(xiàn)Hep-Par-1在胃癌中表達(dá)率達(dá)55.4%(72/130)。Hep-Par-1在其他腫瘤中研究較少，且僅偶見表達(dá)[15]。我們的研究中，Hep-Par-1在HCC中陽性率為81%，在2例HA、6例FNH、28例癌旁肝組織中均為彌漫陽性表達(dá)，因而，Hep-Par-1對(duì)肝細(xì)胞來源的腫瘤無鑒別診斷作用。在11例MAC中1例陽性表達(dá)，這一病例形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為肝樣腺癌，已證實(shí)為胃癌來源，其余10例MAC為非胃癌來源，均未見表達(dá)。在12例ICC中無表達(dá)。故Hep-Par-1對(duì)HCC與ICC、MAC鑒別有較高的敏感性及特異性。

在本組HCC病例中，GPC3陰性者Hep-Par-1表達(dá)率為100%(6/6)，Hep-Par-1陰性者GPC3表達(dá)率為92%(11/12)，與單獨(dú)使用GPC3或Hep-Par-1的陽性率無明顯差異，顯示GPC3及Hep-Par-1在HCC中的表達(dá)可能無明顯相關(guān)性。我們在研究中還發(fā)現(xiàn)，兩者同時(shí)為陽性HCC病例占70%(45/64)，至少1種標(biāo)記物陽性HCC病例占98%(63/64)，僅有1例HCC中兩者表達(dá)均為陰性，故聯(lián)合使用可提高HCC檢出敏感性。另外，GPC3表達(dá)在HCC中的特異性遠(yuǎn)高于Hep-Par-1，因此，雖然聯(lián)合應(yīng)用有助提高檢測敏感性，但不影響其特異性。

綜上所述，GPC3及Hep-Par-1在HCC中均顯示出較高的陽性率，前者在特異性上明顯高于后者，聯(lián)合使用可提高HCC的檢出敏感性，且不影響特異性。兩者在HCC與ICC、MAC鑒別中均有較高的應(yīng)用價(jià)值。GPC3可作為HCC診斷的首選一線抗體。

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