武治國 陳明清

大腸癌是世界上高發(fā)惡性腫瘤之一,歐美國家大腸癌的發(fā)病率排在惡性腫瘤的第2位,在中國為第4～6位,近年更有上升趨勢[1]。家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)和遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌(hereditary non-polyposis colorectal cancers,HNPCC)是遺傳性大腸癌的2種主要類型，其中FAP典型的臨床表現(xiàn)為患病者從青春期開始結(jié)直腸黏膜出現(xiàn)彌漫性腺瘤性息肉，如不進(jìn)行及時(shí)恰當(dāng)?shù)尼t(yī)學(xué)干預(yù)，將在30歲左右發(fā)展成為結(jié)直腸癌，是導(dǎo)致FAP患者死亡的第一位原因[2～4]。目前臨床上，F(xiàn)AP患者的確診多數(shù)依賴?yán)w維結(jié)腸鏡的檢查，但發(fā)現(xiàn)時(shí)一般較晚，無法提供早期診斷。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，F(xiàn)AP相關(guān)致病基因突變篩查可以提供臨床前期診斷，有助于早期預(yù)防及治療。近年來，云南地區(qū)大腸癌發(fā)病率成上升趨勢[5]，且云南人群FAP相關(guān)致病基因研究鮮見報(bào)道，本研究針對(duì)云南省FAP患者相關(guān)致病基因APC基因胚系突變，初步探討該地區(qū)FAP患者致病基因突變特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

10個(gè)FAP家系先證者(漢族7例，彝族2例，白族1例)分別來自云南省昆明市、昭通市、大理州、紅河州，均經(jīng)手術(shù)和(或)家族史證實(shí)為FAP(或伴癌變)患者。經(jīng)患者同意后由其介紹和引導(dǎo)其直系和旁系各級(jí)親屬進(jìn)行遺傳學(xué)咨詢，并以先證者為中心繪制3代以上家系圖譜(圖1)。

圖1 云南省10個(gè)FAP家系圖譜

1.2 基因突變檢測方法

1.2.1 DNA提取 獲取書面知情同意書后，抽取10名先證者及其家系成員外周靜脈血各5 ml，以0.5 mmol/L 1 ml的EDTA抗凝。應(yīng)用QIAamp DNA抽提試劑盒(Qiagen，Germany)按照試劑盒說明書提取DNA，應(yīng)用分光光度法測定DNA濃度及純度，-20℃冰箱冷藏備用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)APC基因各外顯子的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物共35對(duì)，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)在MyCycler PCR儀(Bio-RaD，USA)上進(jìn)行，反應(yīng)總體積為30 μL∶100 ng基因組DNA，1×PCR緩沖液，2.5 mM MgCl2,10 mM dNTP，正向和反向引物各3.3 μM，1U Taq DNA聚合酶。反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)稍加調(diào)整:95℃預(yù)變性5 min(1個(gè)循環(huán))；95℃變性30 s，57℃～61℃退火(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)各引物退火溫度)30 s，72℃延伸30 s(35個(gè)循環(huán))；72℃最終延伸10 min (1個(gè)循環(huán))。

1.2.4 DNA測序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后上ABI PRISMTM-3730XL DNA測序儀 (Applied Biosystem,Foster City,CA,USA)進(jìn)行雙向DNA測序，測序引物與PCR引物相同，測序試劑為BigDyeRTerminator V3.1 Cycle Sequencing Kit。

1.2.5 測序分析 應(yīng)用Chromas 2.3軟件分析測序結(jié)果，參考美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(NCBI)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上APC基因序列(NM-000038)，進(jìn)行序列比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 DNA提取結(jié)果

應(yīng)用分光光度法測定DNA濃度：40～100 ng/μL；純度：OD260/OD280=1.6～1.8。

2.2 PCR擴(kuò)增效果

2%瓊脂凝膠電泳結(jié)果顯示，APC基因15個(gè)外顯子均得到成功擴(kuò)增，PCR反應(yīng)產(chǎn)物均為單一區(qū)帶，大小與預(yù)計(jì)擴(kuò)增一致。

2.3 DNA測序結(jié)果

2.3.1 APC基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP) 對(duì)10個(gè)FAP家系先證者APC基因全編碼區(qū)行突變檢測，檢出漢族J家系先證者APC基因發(fā)生無義突變，其他的6個(gè)漢族和3個(gè)少數(shù)民族家系中未發(fā)現(xiàn)APC基因致病性突變，僅檢測出SNP,包括Y486Y、T1493T、G1678G、D1822V、S1756S、P1960P。經(jīng)http://www.mutationdiscovery.com/md/MD.com/home_page.jsp網(wǎng)站上SNP數(shù)據(jù)查對(duì)，為正常人群中常見突變，均屬于SNP，考慮為非致病突變。

2.3.2 APC基因致病性突變 漢族J家系先證者APC基因檢測出無義突變(圖2)，因APC基因上核苷酸3587C>A，導(dǎo)致15外顯子密碼子1196從編碼絲氨酸(Ser)變?yōu)榻K止密碼子(S1196X)，因終止密碼子提前出現(xiàn)，從而使APC蛋白呈截短改變。經(jīng)APC基因突變數(shù)據(jù)庫(http：//www.umd.be/APC和http://www.china-hvp.org/LOVD/home.php?%20select_db=APC)查對(duì)，國外有此突變報(bào)道，但國內(nèi)尚未見此突變的相關(guān)報(bào)道。此外，該家系還檢出位于15外顯子T1493T、G1678G、D1822V、P1960P的突變，屬于SNP，考慮為非致病突變。

圖2 家族性腺瘤性息肉病患者J家系A(chǔ)PC基因測序圖箭頭表示在此點(diǎn)為單核苷酸突變APC基因c.3587C>A

根據(jù)J家系先證者APC基因核苷酸3587C>A這一突變位點(diǎn)，篩查該家系其他8名成員，7人檢出此突變(圖1-J家系)，并經(jīng)結(jié)直腸鏡檢查證實(shí)，成員Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ4均發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸數(shù)百個(gè)息肉；成員Ⅲ2、Ⅲ3分別為18和16歲，在降結(jié)腸和直腸部位可見十幾個(gè)息肉；Ⅲ4僅12歲，腸鏡未檢查出息肉，為基因突變攜帶者；成員Ⅲ1未攜帶這一突變，鏡下未見息肉。Ⅰ2于1991年在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院行全結(jié)腸切除術(shù)，Ⅱ2在昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院接受預(yù)防性全結(jié)腸切除手術(shù)。

3 討論

3.1 FAP家系進(jìn)行致病基因檢測的意義及方法

FAP是1種常染色體顯性遺傳病，位于5q21的APC基因突變是其發(fā)生的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。自1986年Herrera首次報(bào)道APC基因后，此基因的結(jié)構(gòu)及功能被認(rèn)識(shí)的越來越深入，其編碼的APC蛋白有多個(gè)功能區(qū)域，直接參與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑，并在細(xì)胞-細(xì)胞間黏附、細(xì)胞骨架的微管穩(wěn)定、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用[7]，到目前為止，已發(fā)現(xiàn)APC基因致病突變超過700多種[8]。此次研究的10個(gè)家系，均進(jìn)行了至少3代的家系調(diào)查，其中D家系和G家系中的患者無明確的家族史，考慮是新發(fā)患者，與文獻(xiàn)報(bào)道20%的FAP病例無家族史相一致[9]。無論是新發(fā)FAP患者還是有家族史的FAP患者，都符合孟德爾遺傳定律，他們的子代都有50%的可能通過遺傳而攜帶突變的基因，因此，對(duì)FAP家系成員進(jìn)行突變基因篩查具有重要意義。

3.2 云南地區(qū)FAP家系A(chǔ)PC基因突變分析

在檢測出有APC基因突變的J家系中，APC基因由第15外顯子上1196密碼子從編碼絲氨酸變?yōu)榻K止密碼子(S1196X)，由于是終止密碼子提前出現(xiàn)，使APC蛋白呈截短改變，這種截短的APC蛋白丟失了其氨基端相當(dāng)一部分的氨基酸序列，從而喪失其抑制腫瘤發(fā)生的生物學(xué)功能而引發(fā)腫瘤。隨后對(duì)其家系另外8名成員行該突變位點(diǎn)的檢測，其中7名成員有此突變，除一名12歲的基因突變攜帶者，由于未到發(fā)病年齡沒發(fā)現(xiàn)息肉外，其他突變成員均經(jīng)腸鏡檢查出息肉。因此，APC基因S1196X突變是引起這一FAP家系發(fā)病的原因，并且，通過對(duì)這一家系成員進(jìn)行基因篩查，發(fā)現(xiàn)了早期的FAP患者Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅲ2、Ⅲ3及無臨床表現(xiàn)的致病基因攜帶者Ⅲ4，早期給予醫(yī)學(xué)干預(yù)。

此次對(duì)云南省10個(gè)FAP家系的APC基因進(jìn)行分析，僅檢出1個(gè)漢族家系有APC基因致病突變，突變檢出率遠(yuǎn)低于國內(nèi)、外報(bào)道[9～14]的23.3%～78.6%和48%～87.7%。這次研究中，我們沒能確定其余9個(gè)家系的致病原因，其APC基因突變低檢出率可能的原因考慮有以下3個(gè)方面:第一，F(xiàn)AP患者APC基因突變率可能會(huì)存在著民族間、地域間的差異。由于不同民族不同地區(qū)的人群，其遺傳物質(zhì)本身存在差異或長期地理隔離造成的生存環(huán)境的差異而導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的差異，國內(nèi)外現(xiàn)有報(bào)道已提示FAP患者APC基因的檢出率在不同人種、不同地區(qū)存在差異。云南是個(gè)多民族的邊疆省份，包括漢族和彝、白、回、苗、傣、傈僳、哈尼等25個(gè)少數(shù)民族以多民族大雜居、小聚居分布為特點(diǎn)，具有不同民族遺傳結(jié)構(gòu)的多樣性和民族背景的單一性，APC基因突變的低檢出率有可能存在云南省地區(qū)差異的因素。第二，APC基因突變陰性的FAP患者是否存在其他致病基因和修飾基因的突變。有學(xué)者報(bào)道[15]，在未檢出APC基因突變的FAP患者中，堿基剪切修復(fù)基因MYH (MutY human homologue，MYH)基因突變有25%的檢出率。Renkonen等[16]在未檢測到APC基因變異的FAP患者中，也指出有MYH或AXIN2基因的變異。FAP患者除與APC基因突變有關(guān)外，可能還存在其他發(fā)病機(jī)制。第三，APC基因突變可能存在于這些家系中，但目前檢測方法的限制，無法檢測出突變部位及類型。最近，有學(xué)者報(bào)道衰減型FAP(attenuated FAP,AFAP)患者內(nèi)含子突變，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄時(shí)剪切位點(diǎn)發(fā)生變化。Neklason等[17]報(bào)道1例AFAP患者4號(hào)內(nèi)含子突變導(dǎo)致APC基因4號(hào)外顯子表達(dá)缺失。我們這次研究應(yīng)用DNA直接測序方法，對(duì)FAP患者APC基因的全編碼區(qū)(15個(gè)外顯子)進(jìn)行檢測，內(nèi)含子未在檢測范圍內(nèi)。另外，DNA直接測序?qū)虼笃稳笔Щ蛘麄€(gè)外顯子的缺失目前無法檢出。雖然APC基因的大片段缺失在FAP患者中不超過2%[14,18]，內(nèi)含子突變致病的報(bào)道也很罕見，但這些也可能是造成我們研究中APC基因突變低檢出率的原因。

因此，對(duì)于FAP患者的基因篩查除主要的致病基因APC基因外，其他一些候選基因和修飾基因還需進(jìn)一步深入研究，F(xiàn)AP基因篩查策略仍需進(jìn)一步完善[19]。

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