尹紅英 王紅兵

基因的突變、缺失是抑癌基因失活的主要途徑，近年來(lái)研究表明啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化是導(dǎo)致抑癌基因失活的又一重要途徑[1]。乳腺癌易感基因 ( breast cancer susceptibility gene,BRCA1)是參與多種腫瘤發(fā)生的抑癌基因[2]，研究表明其參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡和泛素化等重要的細(xì)胞活動(dòng)[3]。本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)技術(shù)，檢測(cè)耐紫杉醇人肺腺癌A549細(xì)胞株BRCA1基因啟動(dòng)子CpG島甲基化的狀態(tài)，以探討A549/Taxol細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京TIANGEN公司；BRCA1基因甲基化檢測(cè)試劑盒為GENMED公司產(chǎn)品；PCR試劑盒為 Promega公司產(chǎn)品；引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成；耐紫杉醇人肺腺癌 A549細(xì)胞株(A549/Taxol)購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 A549/Taxol細(xì)胞培養(yǎng) 取A549/Taxol細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 甲基化特異性PCR(MSP) 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A549/Taxol細(xì)胞，參照基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取基因組DNA，在UV 3 000紫外分光光度儀上測(cè)定吸光度值鑒定DNA純度，OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間。取2 μg基因組DNA，參照BRCA1基因甲基化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行甲基化修飾。分別取修飾DNA及未修飾DNA 100 ng進(jìn)行MSP反應(yīng)。BRCA1基因甲基化引物：M，F(xiàn)：5′- TCGTGGTAACGGAAAAGCGC-3′，R：5′- AAATCTCAACGAACTCACGCCG-3′。非甲基化引物：U,F：5′- TTGGTTTTTGTGGTAATGGAAAAGTGT-3′，R：5′-CAAAAAATCTCAACAAAC-TCACACCA-3′。反應(yīng)體系按照PCR試劑盒推薦量25 μl體系進(jìn)行：PCR混合液12.5 μl，上下游引物各1 μl，模板1 μl，無(wú)核酶水9.5 μl。MSP循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性12 min，95 ℃變性40 s，甲基化引物60℃退火45 s，非甲基化引物在57 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)擴(kuò)增35次，72℃ 10 min。應(yīng)用Gene Amp PCR System 2400擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司)。甲基化特異性引物(M)擴(kuò)增的目的片段為75 bp，非甲基化特異性引物(U)擴(kuò)增的目的片段為86 bp。取10 μl PCR產(chǎn)物在2.5﹪瓊脂糖凝膠上電泳，以TIANGEN 50 bp DNA Ladder(MD108-01)為標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker同步電泳，紫外燈下觀察，凝膠成像系統(tǒng)記錄并分析。判斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：M陽(yáng)性、U陰性為完全甲基化；M陽(yáng)性、U陽(yáng)性為部分甲基化；M 陰性、U陽(yáng)性為非甲基化。

2 結(jié)果

MSP結(jié)果顯示，耐紫杉醇人肺腺癌A549細(xì)胞(A549/Taxol)中BRCA1基因呈部分甲基化，見圖1。

圖1 BRCA1基因甲基化檢測(cè)(MSP) M為甲基化(75 bp)，U為非甲基化(86 bp)

3 討論

肺癌嚴(yán)重威脅人類生命與健康，其發(fā)病隱匿，進(jìn)展迅速，約2/3患者確診時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，化療是綜合治療中的主要措施之一。紫杉醇由太平洋紫杉屬短葉紫杉中提取，它通過(guò)促進(jìn)微管聚合、抑制微管解聚影響細(xì)胞的有絲分裂，進(jìn)而發(fā)揮其細(xì)胞毒作用。該藥因其顯著的抗癌作用而被用于肺癌化療的一線用藥，但因易產(chǎn)生耐藥，在很大程度上影響了其長(zhǎng)期療效。

BRCA1基因自 1994年被成功定位分離后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了廣泛而深入的研究，BRCA1基因定位在17q21，是抑癌基因，阻滯細(xì)胞周期于G/M期。目前已知BRCA1基因是重要的功能基因[5]，參與細(xì)胞周期調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA損傷修復(fù)。BRCA1基因還具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制轉(zhuǎn)移和血管生成的作用。引起B(yǎng)RCA1基因表達(dá)缺失的機(jī)制主要有突變和 DNA甲基化。BRCA1基因突變與家族性乳腺癌及卵巢癌的發(fā)生密切相關(guān)，BRCA1基因啟動(dòng)子甲基化主要發(fā)生在散發(fā)性乳腺癌和卵巢癌[6]。目前BRCA1基因甲基化的研究主要集中在乳腺癌及卵巢癌，在肺癌方面報(bào)道甚少。耐紫杉醇人肺腺癌A549細(xì)胞株BRCA1基因甲基化的相關(guān)基礎(chǔ)研究目前尚無(wú)報(bào)道。

近年來(lái)，人們逐漸認(rèn)識(shí)到腫瘤是在環(huán)境因素的作用下通過(guò)遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的改變而發(fā)生的，包括癌基因的活化和抑癌基因的失活。表觀遺傳學(xué)包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼 RNA等。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)中研究最多的基因調(diào)控方式。抑癌基因啟動(dòng)子甲基化可抑制基因表達(dá)而使其功能喪失，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。與遺傳學(xué)改變不同，表觀遺傳學(xué)改變?cè)谝欢l件下可以逆轉(zhuǎn)，這一特性為疾病的治療提供新的機(jī)遇，也成為近年的研究熱點(diǎn)[7]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)技術(shù)，檢測(cè)耐紫杉醇人肺腺癌 A549細(xì)胞BRCA1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，結(jié)果A549/Taxol細(xì)胞BRCA1基因啟動(dòng)子CpG島區(qū)域存在甲基化，呈部分甲基化，為下一步研究提供依據(jù)。

[1] Deaton AM,Bird A.CpG islands and the regulation of transcription〔J〕.Genes Dev,2011,25(10):1010.

[2] Hong H,Yen HY,Brockmeyer A,et al.Changes in the mouse estrus cycle in response to BRCA1 inactivation suggest a potential link between risk factors for familial and s sporadic ovarian cancer〔J〕.Cancer Res,2010,70 (1):221.

[3] Morris JR,Boutell C,Keppler M,et al.The SUMO modification path-way is involved in the BRCA1 response to genotoxic stress〔J〕.Nature,2009,462 (7275):886.

[4] 王紅兵,王亞麗,劉德生,等.尿多酸肽對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的作用及人肺腺癌A549細(xì)胞株E-cadherin基因甲基化的研究〔J〕.實(shí)用癌癥雜志,2010,25(5):445.

[5] Antill YC,Mitchell G,Johnson SA,et al.Gene methylation in breast ductalfluid from BRCA1and BRCA2 mutation carriers〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2010,19 (1):265.

[6] Kleer CG.Carcinoma of the breast with medullary-like features:diagnostic challenges and relationship with BRCA1 and EZH2 functions〔J〕.Arch Pathol Lab Med,2009,133 (11):1822.

[7] Cai FF,Kohler C,Zhang B,et al.Epigenetic therapy for breast cancer〔J〕.Int J Mol Sci,2011,12(7):4465.