宋佳蕾，繩秀珍，戰(zhàn)文斌

（中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003）

免疫細(xì)胞化學(xué)法測定魚類淋巴囊腫病毒（LCDV）滴度＊

宋佳蕾，繩秀珍＊＊，戰(zhàn)文斌

（中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003）

利用免疫細(xì)胞化學(xué)法測定魚類淋巴囊腫病毒（LCDV）滴度。以牙鲆鰓細(xì)胞系（FG）作為感染細(xì)胞，將生長旺盛的FG細(xì)胞接種于48孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)至形成細(xì)胞單層，用2倍連續(xù)稀釋的LCDV粗提液分別接種FG細(xì)胞。固定各稀釋度LCDV感染后的FG細(xì)胞，孵育抗牙鲆LCDV單克隆抗體，其后再運(yùn)用生物素－親合素反應(yīng)系統(tǒng)，以堿性磷酸酶底物APRed試劑盒發(fā)色。倒置顯微鏡觀察，被病毒感染的FG細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色，未被感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈無色。記錄各稀釋度病毒感染的陽性細(xì)胞孔數(shù)，按Reed－Muench法計算組織細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）。結(jié)果顯示，免疫細(xì)胞化學(xué)法測得LCDV在FG的滴度為1.77×210TCID50／mL。該法可以用來有效測定LCDV滴度，且結(jié)果直觀、準(zhǔn)確性較好，靈敏度較高。

淋巴囊腫病毒；牙鲆鰓細(xì)胞；組織細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量；免疫細(xì)胞化學(xué)法

魚類淋巴囊腫?。↙ymphocystis disease，LCD）是1種典型的皮膚和淺表組織慢性病毒性疾病，呈世界性分布，可感染已知至少140種海水、半咸水和淡水魚類，是對魚類危害較為嚴(yán)重的病毒病之一，感染率可高達(dá)80%，死亡率可達(dá)30%，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失［1］。其病原為淋巴囊腫病毒（Lymphocystis disease virus，LCDV），隸屬虹彩病毒科（Iridoviridae），淋巴囊腫病毒屬（Lymphocystivirus）［2］。研究發(fā)現(xiàn)LCDV可在藍(lán)鰓魚幼魚細(xì)胞系BF－2、日本牙鲆胚胎細(xì)胞系HINAE、草魚腎細(xì)胞系GCK、牙鲆鰓細(xì)胞系FG等細(xì)胞內(nèi)增殖并引起細(xì)胞病變（CPE）［3－6］。

病毒滴度的測定是研究病毒特性的重要手段，也是病毒學(xué)研究中的基礎(chǔ)方法。目前其測定方法有多種，如微量細(xì)胞病變法、空斑法、熒光法、紅外熒光法、ELISA法、免疫斑點(diǎn)法、流式細(xì)胞儀法、熒光實(shí)時定量PCR法等［7－14］。以測定組織細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）為基礎(chǔ)的終點(diǎn)稀釋法和以測定蝕斑形成單位（PFU）為基礎(chǔ)的蝕斑滴定法是常用的病毒滴度測定方法［15］。終點(diǎn)稀釋法相對于蝕斑滴定法，速度快，操作簡便，重復(fù)性好［16］。該法將一系列梯度稀釋病毒液分別接種于培養(yǎng)細(xì)胞單層，經(jīng)過一定時間后觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)CPE，以最高病毒稀釋度能感染50%細(xì)胞的量為終點(diǎn)，用Reed－Muench法或Karber法計算出TCID50表示病毒滴度［7，17］。本文選擇FG細(xì)胞作為感染細(xì)胞測定LCDV的滴度，將LCDV粗提液接種于FG細(xì)胞單層，通過血清學(xué)反應(yīng)和細(xì)胞染色判定病毒感染的細(xì)胞區(qū)域及細(xì)胞的感染程度，以免疫細(xì)胞化學(xué)法測定LCDV TCID50，相對于終點(diǎn)稀釋法，具有結(jié)果直觀、準(zhǔn)確性好，靈敏度高的特點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

患LCD牙鲆取自山東某養(yǎng)殖場，病魚的體表可見有單個或聚集成團(tuán)的水泡狀囊腫物；FG細(xì)胞系由中國海洋大學(xué)生命學(xué)院惠贈［18］；抗LCDV不同表位的單克隆抗體（1A8、1D7、2D11）由本實(shí)驗(yàn)室制備［19］，使用前等比例混合；胰蛋白酶Trypsin 1：250購自Amresco公司；MEM／EBSS培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司；牛血清白蛋白（BSA）、生物素化馬抗小鼠IgG（H＋L）、堿性磷酸酶標(biāo)記鏈親和素、堿性磷酸酶底物AP－Red試劑盒購自Sigma公司。

1.2 LCDV粗提液的制備

將患LCD牙鲆體表的囊腫切下，剝?nèi)ネ饽ぃ尤脒m量石英砂，用TNE緩沖液（0.05mol／L Tris－HCl，0.15mol／L NaCl，0.01mol／L EDTA，pH＝7.4）按1∶10比例進(jìn)行研磨。冰浴勻漿，勻漿液600r／min，離心30min，取上清。1 800r／min再次離心30min，收集上清，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾除菌，分裝于1.5 mL無菌離心管中，－80℃保存。

1.3 FG細(xì)胞單層的培養(yǎng)

將25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)生長旺盛的致密FG細(xì)胞（細(xì)胞密度約為3×105／mL）用細(xì)胞清洗液（含0.02%EDTA的PBS）洗滌2次，加入300μL 0.25%的胰蛋白酶消化，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓后，加入10mL細(xì)胞培養(yǎng)液（MEM／EBSS培養(yǎng)基，10%FBS）吹打均勻制備細(xì)胞懸液，接種于48孔培養(yǎng)板中，每孔200μL。22℃，2%CO2培養(yǎng)24h后匯合率約為70%用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 FG細(xì)胞上LCDV的感染

用MEM／EBSS培養(yǎng)基將LCDV粗提液按2－4、2－5、2－6、2－7、2－8、2－9、2－10稀釋。吸去48孔培養(yǎng)板中細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，分別接種各梯度濃度的病毒粗提液，每個稀釋度接種6孔，每孔100μL。陰性對照加MEM／EBSS培養(yǎng)基代替病毒粗提液。22℃吸附1h后，加入細(xì)胞維持液（MEM／EBSS培養(yǎng)基，2%FBS）200μL，22℃，2%CO2培養(yǎng)。

1.5 TCID50的測定

1.5.1 免疫細(xì)胞化學(xué)法 按1.3的方法培養(yǎng)FG細(xì)胞單層。按1.4的方法感染FG細(xì)胞。病毒感染細(xì)胞后72h，棄細(xì)胞維持液，用PBS將FG細(xì)胞清洗2遍，4%多聚甲醛固定10min；0.1%Triton X－100通透10 min；3%BSA封閉1h，吸去BSA；以抗LCDV單克隆抗體（1A8、1D7、2D11）為第一抗體加在細(xì)胞上，37℃孵育1h，PBST（含0.05%tween－20）浸洗3次，每次5 min；加生物素標(biāo)記的馬抗小鼠IgG，37℃孵育1h，PBST浸洗3次，每次5min；加堿性磷酸酶標(biāo)記鏈親和素，37℃孵育1h，PBST浸洗3次，每次5min；以堿性磷酸酶底物AP－Red試劑盒發(fā)色10min；蘇木精復(fù)染1min，0.1%鹽酸分色，藍(lán)化。倒置顯微鏡下觀察，被LCDV感染的FG細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色為陽性，沒有被病毒感染的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈無色為陰性；經(jīng)蘇木精復(fù)染后細(xì)胞核均呈現(xiàn)藍(lán)色。記錄被不同稀釋度病毒感染的陽性細(xì)胞孔數(shù)。按Reed－Muench法計算

1.5.2 終點(diǎn)稀釋法 按1.3的方法培養(yǎng)FG細(xì)胞單層。按1.4的方法感染FG細(xì)胞。每天在倒置顯微鏡下觀察孔內(nèi)細(xì)胞是否出現(xiàn)CPE，當(dāng)CPE不再發(fā)展時，記錄被不同稀釋度病毒感染出現(xiàn)CPE的細(xì)胞孔數(shù)。按上述方法計算TCID50。

2 結(jié)果

2.1 正常FG單層細(xì)胞的形態(tài)觀察

FG細(xì)胞消化后，細(xì)胞皺縮變圓（見圖1B）。細(xì)胞傳代48～72h后形成生長旺盛的單層，貼壁生長。細(xì)胞輪廓清晰，呈梭形、三角形、多角形等形態(tài)，具有長短不等的兩個或數(shù)個細(xì)胞突起，形態(tài)飽滿，大小均勻，呈現(xiàn)旺盛的生長趨勢（見圖1A）。

圖1 消化前后FG細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征（bar＝100μm）Fig.1 FG cells before or after administration of 0.25%trypsin（bar＝100μm）

2.2 感染病毒后細(xì)胞的形態(tài)觀察

2.2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測LCDV對FG細(xì)胞的感染

接種2－4～2－8LCDV粗提液的FG細(xì)胞病毒感染后72h，免疫細(xì)胞化學(xué)法均可檢測到陽性細(xì)胞。隨著病毒稀釋度的增大，檢測到陽性細(xì)胞的比例減少。接種2－4LCDV粗提液的FG細(xì)胞，各孔陽性細(xì)胞呈彌漫性分布且視野中大部分為陽性細(xì)胞；接種2－5～2－6LCDV粗提液的FG細(xì)胞，各孔陽性細(xì)胞呈現(xiàn)區(qū)域性的成堆狀分布；接種2－7～2－8LCDV粗提液的FG細(xì)胞，少數(shù)孔中有少量陽性細(xì)胞存在；接種大于2－8LCDV粗提液的FG細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)法未檢測到陽性細(xì)胞。

免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測可見細(xì)胞單層感染區(qū)域嚴(yán)重病變FG細(xì)胞呈現(xiàn)灶狀空斑，細(xì)胞聚集，多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色（見圖2A）；部分被病毒感染FG細(xì)胞變圓，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)明顯的紅色；部分被病毒感染但形態(tài)未發(fā)生明顯變化的細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色（見圖2C）；未被病毒感染FG細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)不著紅色（見圖2A，2C）；對照組FG細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞質(zhì)不著紅色（見圖3E）；經(jīng)蘇木精復(fù)染后所有細(xì)胞的細(xì)胞核均呈現(xiàn)藍(lán)色（見圖2B，2D，2F）。

2.2.2 終點(diǎn)稀釋法觀察CPE 倒置顯微鏡下觀察接種不同稀釋度LCDV的FG細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)2－4～2－6LCDV病毒粗提液均能引起CPE，隨著病毒稀釋度的增大，F(xiàn)G細(xì)胞出現(xiàn)病變的時間延后，病變細(xì)胞減少，隨著感染時間的延長，病變細(xì)胞的數(shù)量增多，病變程度逐漸加重，病毒感染細(xì)胞120h后CPE不再變化。接種2－4～2－5LCDV病毒粗提液24～48h，F(xiàn)G細(xì)胞開始出現(xiàn)病變，72h出現(xiàn)少量死亡細(xì)胞，96～120h死亡細(xì)胞的數(shù)目增多，各孔均出現(xiàn)不同程度的CPE；接種2－6LCDV病毒粗提液，48h只有少數(shù)細(xì)胞病變，72～120h病變細(xì)胞數(shù)量增多，部分孔中細(xì)胞出現(xiàn)病變；接種稀釋度大于或等于2－7LCDV粗提液的FG細(xì)胞病毒感染120h后未出現(xiàn)CPE。

LCDV感染FG細(xì)胞引起的CPE開始表現(xiàn)為病變細(xì)胞單層局部出現(xiàn)細(xì)胞間隙增大，疏松。部分細(xì)胞的輪廓逐漸失去突起，細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞空泡化逐漸加重（見圖3A，3B，3C）。隨著病變程度的加深，有的細(xì)胞破裂，從培養(yǎng)板底部脫落，形成灶狀空斑（見圖3D，3E）。對照組FG細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞狀態(tài)良好，無CPE產(chǎn)生（見圖3F）。

2.3 FG細(xì)胞上LCDV滴度的測定

LCDV感染FG細(xì)胞后72h，免疫細(xì)胞化學(xué)法測得病毒的滴度為1.77×210TCID50／mL。LCDV感染FG細(xì)胞120h后，出現(xiàn)CPE的細(xì)胞孔數(shù)目不再增加，終點(diǎn)稀釋法以使50%感染細(xì)胞產(chǎn)生CPE的最高病毒稀釋度作為判定結(jié)果，測得病毒的滴度為1.65×29TCID50／mL。

3 討論

測定病毒滴度時，首先需要選擇合適的感染細(xì)胞。已有報道感染LCDV后的FG細(xì)胞電鏡下觀察到細(xì)胞中有病毒粒子，光鏡下觀察到細(xì)胞脫落死亡出現(xiàn)蝕斑，免疫熒光法檢測到細(xì)胞質(zhì)中熒光信號的存在［6，20－21］，說明LCDV能在FG細(xì)胞中復(fù)制增殖引起感染，F(xiàn)G細(xì)胞是測定LCDV滴度的有效材料。關(guān)于病毒對細(xì)胞的感染，由于FBS中存在一些遮蔽細(xì)胞膜表面病毒受體的非特異性蛋白質(zhì)、補(bǔ)體或其他小分子物質(zhì)［22］，本文在接種病毒時，先用PBS清洗細(xì)胞單層，避免FBS的干擾使病毒對細(xì)胞的吸附量減少，從而降低病毒對細(xì)胞的感染。病毒吸附后采取加入FBS含量低的細(xì)胞維持液，使細(xì)胞代謝緩慢進(jìn)行，延長細(xì)胞存活時間，防止?fàn)I養(yǎng)耗盡、代謝產(chǎn)物積聚、pH值下降等因素導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變、脫落、死亡等現(xiàn)象而影響病毒滴度的測定。

TCID50已被用于許多種病毒的滴度測定，表示使50%的培養(yǎng)細(xì)胞感染，產(chǎn)生CPE的最小病毒量［11］。以測定TCID50為基礎(chǔ)的終點(diǎn)稀釋法根據(jù)光鏡下觀察接種病毒細(xì)胞單層上CPE的出現(xiàn)判定病毒的感染［7］。CPE是病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖及其對細(xì)胞產(chǎn)生損害的最明顯的表現(xiàn)，因此可作為病毒感染細(xì)胞確切、直觀的證據(jù)之一。然而當(dāng)病毒濃度降低時，CPE程度減弱，細(xì)胞形態(tài)特征變化不明顯。而且感染性病毒液中潛在的細(xì)胞毒性因子和環(huán)境因素作用于細(xì)胞導(dǎo)致的病變可能被誤判為由病毒引起的CPE，同時正常細(xì)胞在培養(yǎng)數(shù)日之后，老化狀態(tài)不好也會出現(xiàn)類似CPE一樣的細(xì)胞變圓現(xiàn)象［5］。因此，CPE的判斷需要操作者具備一定經(jīng)驗(yàn)，可能會產(chǎn)生人為偏差，降低了精確度。本文采用免疫細(xì)胞化學(xué)法測定被LCDV感染FG細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色，未被感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)不著色，經(jīng)蘇木精復(fù)染后，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，結(jié)果對比明顯，易判斷，提高了檢測的準(zhǔn)確性和效率。

基于抗原抗體反應(yīng)的免疫細(xì)胞化學(xué)法借助相應(yīng)的已知免疫血清或抗體可用來測定組織細(xì)胞內(nèi)病毒［21］，被應(yīng)用于流行性乙型腦炎病毒、登革熱病毒等病毒的滴度測定［15］。本文將免疫細(xì)胞化學(xué)法應(yīng)用于LCDV的滴度測定，利用3株針對不同抗原決定簇的抗LCDV單克隆抗體的混合物作為第一抗體檢測FG細(xì)胞內(nèi)LCDV，可以特異結(jié)合較多的病毒蛋白抗原結(jié)合位點(diǎn)，以得到較強(qiáng)的陽性反應(yīng)。另外，生物素－親合素反應(yīng)系統(tǒng)的引入，通過生物素偶聯(lián)的馬抗小鼠IgG第二抗體與堿性磷酸酶標(biāo)記鏈親合素之間的強(qiáng)親合作用和多價反應(yīng)性檢測分析感染細(xì)胞中的病毒蛋白，提高了感染細(xì)胞的檢出率。免疫細(xì)胞化學(xué)法可檢測到2－8LCDV感染FG細(xì)胞后少量細(xì)胞中病毒的存在，而2－8LCDV感染120h后的FG細(xì)胞未觀察到CPE現(xiàn)象。相對于終點(diǎn)稀釋法，免疫細(xì)胞化學(xué)法更加靈敏。

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Development of a Virus Titration Assay for Lymphocystis Disease Virus by an Immunocytochemical Staining Method

SONG Jia－Lei，SHENG Xiu－Zhen，ZHAN Wen－Bin

（The Key Laboratory of Mariculture，Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

An immunocytochemical staining method was developed for virus titration assay of lymphocystis disease virus（LCDV）in cultures of a flounder gill（FG）cell line.FG cells were propagated into a 48 well tissue culture plate and post inoculated with two－fold serially diluted LCDV，purified from lymphocystis cells of Japanese flounder Paralichthys olivaceus.After infection，the cell cultures were fixed and incubated with LCDV－specific monoclonal antibody in combination with biotin－avidin system.Infected cells and uninfected cells，stained with alkaline phosphatase substrate，could be differentiated by presence and absence of red color in the cytoplasm.Each positive well was scored microscopically based on the appearance of immunostained cells and the titer of the LCDV infectivity in FG cells was measured to be 1.77×210TCID50per mL by the immunocytochemical staining method.The immunocytochemical staining method is proved to be accurate and sensitive for measuring the titer of LCDV.

lymphocystis disease virus；flounder gill cells；TCID50；immunocytochemical staining method

R446.63

A

1672－5174（2012）05－055－05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31172429；31072232）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項(xiàng)目（2006AA100306）資助

2011－01－19；

2011－04－18

宋佳蕾（1986－），女，碩士生，主要從事水產(chǎn)病害與免疫學(xué)研究。

＊＊通訊作者：Tel：0532－82032284；E－mail：xzsheng＠ouc.edu.cn

責(zé)任編輯 王 莉