寧顯忠，趙德福

(遼寧醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院神經內科,遼寧錦州 121000)

近年來，促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)的神經保護作用得到越來越多的學者的認可，但對EPO發(fā)揮神經保護功能的具體機制和途徑目前尚知之甚少。眾所周知，以白細胞侵入為主要標志的炎癥反應是造成腦缺血-再灌注損傷的特征性改變。其中炎癥細胞因子誘發(fā)的黏附分子表達上調和由后者介導的白細胞與內皮細胞的相互作用，是炎癥反應的關鍵因素[1]。黏附分子當中比較重要的是細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecules1,ICAM-1)及血管細胞間黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule1,VCAM-1)的。腦缺血后多種炎性細胞因子誘導腦微血管內皮細胞表達ICAM-1和VCAM-1，二者通過與白細胞上的相應受體結合，導致白細胞與內皮細胞黏附、游出，進而浸潤到血管外腦實質，造成腦損傷。本研究通過驗證EPO對誘發(fā)炎癥反應的ICAM-1和VCAM-1是否發(fā)揮抑制作用為切入點，著重探討EPO對腦缺血-再灌注損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠216只，體質量250～300 g，由遼寧醫(yī)學院動物中心提供。

1.2藥品與試劑 注射用重組人EPO(批號A20101001)為成都地奧九泓制藥廠產品，ICAM-1、VCAM-1抗體(貨號分別為sc-1511和sc-8304)為美國Santa Cruz公司產品。

1.3方法

1.3.1分組與給藥 將實驗大鼠隨機分為以下3組：(1)EPO干預組72只，缺血2 h后EPO腹腔注射，參照文獻[2]選擇EPO的有效劑量為3 000 U/kg，用生理鹽水溶解，濃度為200 U/mL，給藥后分別于再灌注3、6、12、24、48和72 h后取海馬組織；(2)模型組72只，按模型標準制成大鼠腦缺血-再灌注模型，分別于缺血2 h后腹腔注射等量生理鹽水，于再灌注3、6、12、24、48和72 h后取海馬組織；(3)假手術組72只，只進行手術操作，不進行缺血-再灌注處理，于假手術2 h后腹腔注射等量生理鹽水，分別于上述各時間點斷頭取海馬組織。每個時間點為一個亞組，每亞組12只大鼠。

表1 各組大鼠不同時間點VCAM-1蛋白的表達量

△：P<0.05，△△：P<0.01，與假手術組比較；▲▲：P<0.01，與模型組比較。

表2 各組大鼠不同時間點ICAM-1蛋白的表達量

△△：P<0.01，與假手術組比較；▲：P<0.05，▲▲：P<0.01，與模型組比較。

1.3.2模型的制備 采用線栓法制作大鼠大腦中動脈阻塞模型。水合氯醛麻醉(3 mL/kg)大鼠，分離左側頸總動脈，結扎其近心端，然后在頸總動脈上剪一個小口(約為動脈直徑的1/2)，將充滿肝素的動脈插管插入小口，用手術線結扎固定插管后，將長6 cm的漁線插入動脈插管直至大腦中動脈，腦缺血開始后將動脈插管拔出，把漁線和頸總動脈結扎在一起；2 h后拔出魚線，缺血-再灌注開始，以大鼠出現(xiàn)左側霍納氏征、右前肢伸展受限、活動時向右側旋轉為缺血-再灌注模型制備成功標志。模型組和EPO干預組中的6個亞組分別再灌注3、6、12、24、48和72 h，假手術組6個亞組不進行缺血-再灌注處理。

1.4標本制取與檢測方法

1.4.1免疫組化法檢測海馬區(qū)ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達 每個亞組取大鼠6只，烏拉坦麻醉(5 mL/kg)，灌流固定腦組織，斷頭取海馬組織，將標本置于4%多聚甲醛液中固定，制成厚度為5 μm的病理切片。取上述切片常規(guī)脫蠟，蒸餾水洗滌，3%過氧化氫溶液處理30 min，以去除內源性過氧化物酶，0.01 mol/L PBS洗滌3次(每次5 min);分別滴加適當稀釋的兔抗大鼠ICAM-1一抗或兔抗大鼠VCAM-1-抗，4 ℃孵育過夜，0.01 mol/L PBS洗滌3次(每次5 min);滴加辣根酶標記羊抗兔多聚體(PV6001)，37 ℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗滌3次(每次5 min);二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片，鏡下觀察海馬組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達情況。二者均主要于內皮細胞膜表面表達，呈棕黃色顆粒狀。

1.4.2Western blot分析海馬組織ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達 取每組剩余6只大鼠，麻醉方法同上，取其海馬組織迅速置于―80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆?。Western blot 檢測分為以下6步：(1)制備蛋白樣品；(2)測定上清液蛋白含量；(3) 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳；(4)采用正電荷尼龍膜(PVDF)轉移；(5)雜交；(6)顯色分析，用Gene Genius凝膠圖像系統(tǒng)分析各蛋白目的條帶吸光度，用目的條帶與β-actin條帶吸光度的比值表示目的蛋白的含量。

2 結 果

2.1免疫組化染色結果 觀察區(qū)域主要選擇在大鼠海馬組織的CA1區(qū)，黏附分子的表達部位主要集中在血管內皮細胞表面。結果顯示，假手術組血管內皮細胞表面有極少量VCAM-1和ICAM-1蛋白表達的陽性細胞；與假手術組比較，模型組ICAM-1和VCAM-1蛋白表達的陽性細胞于再灌注6 h開始逐漸增多，再灌注后12～48 h明顯增多，以后有所減少；與模型組各時間點相比較，EPO干預組VCAM-1的表達量從12 h開始減少，24～72 h明顯減少，而ICAM-1從6 h即開始減少，12～72 h明顯減少。

圖1 各組大鼠不同時間點VCAM-1蛋白的

圖2 各組大鼠不同時間點ICAM-1蛋白的

2.2Western blot檢測結果 假手術組有極少量VCAM-1和ICAM-1蛋白的表達。與假手術組比較，模型組再灌注6 h VCAM-1和ICAM-1蛋白可見有少量表達，以后表達量逐漸增多，VCAM-1的表達高峰出現(xiàn)在再灌注24～48 h；而ICAM-1則在再灌注12～48 h一直持續(xù)較高，以后表達量逐漸減少。與模型組各時間點相比較，EPO干預組VCAM-1的表達量從12 h開始減少，24～72 h明顯減少，而ICAM-1從6 h即開始減少，12～72 h明顯減少。見表1、2，圖1、2。

3 討 論

近年來，對于EPO的神經保護作用的關注越來越多。但關于EPO對腦缺血-再灌注后炎癥損傷的抑制作用，尤其是對于誘導炎癥反應的關鍵物質黏附分子的抑制作用，國內外鮮有報道。

本實驗通過線栓法制作成年大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型，觀察VCAM-1和ICAM-1蛋白在腦缺血-再灌注損傷中的作用，以及EPO對此過程的抑制作用。研究結果顯示，在大鼠局灶性腦缺血-再灌注6 h，即有VCAM-1和ICAM-1蛋白的少量表達，不論是陽性細胞數還是表達量都較假手術組有所增加，之后表達量逐漸增多，VCAM-1的表達高峰出現(xiàn)在再灌注24～48 h，而ICAM-1的表達則在再灌注12～48 h一直持續(xù)較高，以后表達量有所減少。需要指出的是，內皮細胞無論在未被激活還是被激活后表達的ICAM-1均高于VCAM-1，并且ICAM-1在腦損傷后的上調表達要早于VCAM-1，而其下降又稍晚于VCAM-1?？梢奍CAM-1相對于VCAM-1容易表達且較穩(wěn)定，也說明前者在腦損傷發(fā)生中起主要作用。

EPO是由腎臟和胚胎肝臟產生的一種能促進紅細胞生成的細胞因子，主要用于治療多種原因所致的貧血。但近年的研究發(fā)現(xiàn)，在許多非造血細胞系如腎、心肌、平滑肌和神經原細胞中也存在EPO及其受體(erythropoietin receptor,EPOR)基因表達[3]。動物實驗和體外細胞培養(yǎng)已證實，EPO對腦缺血具有神經保護作用[4]。本實驗于大鼠缺血后2 h給予EPO腹腔注射，研究結果顯示，與模型組相比較，應用EPO后，EPO干預組VCAM-1和ICAM-1蛋白的陽性細胞數和蛋白表達量均有所下降。而且需要指出的是，ICAM-1于用藥后6 h即開始下降，而 VCAM-1于用藥后12 h才開始下降，表明在誘導炎癥作用時作用相對較大的ICAM-1對EPO的反應也相對較VCAM-1敏感。由此可見，EPO可以通過抑制ICAM-1和VCAM-1蛋白表達的上調(主要是ICAM-1)，實現(xiàn)對腦缺血-再灌注損傷后炎癥損傷的抑制作用。

近幾年來，關于EPO的神經保護作用研究方興未艾，其機制除了抗炎作用以外，目前正在研究中的還有抗谷氨酸興奮毒性[5]、調節(jié)一氧化氮(NO)的合成[6]、抗氧化作用、抗神經元凋亡[7-8]、促進血管生成[9]、促進神經元再生和神經營養(yǎng)作用等。其對腦血管的保護作用正逐漸成為臨床和科研的新熱點[10]。尤其是近來的研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血動物腦內可見EPO和EPOR表達[11]，外源性EPO可通過血腦屏障進入腦內[12]，為EPO的臨床應用墊定了理論基礎。因此，EPO在腦缺血-再灌注損傷的應用方面有廣闊的臨床應用前景。

[1]O′Sullivan JB,Ryan KM,Harkin A,et al.Noradrenaline reuptake inhibitors inhibit expression of chemokines IP-10 and RANTES and cell adhesion molecules VCAM-1 and ICAM-1 in the CNS following a systemic inflammatory challenge[J].J Neuroimmunol,2010,220(1/2):34-42.

[2]Li Y,Lu ZY,Keogh CL,et al.Erythropoietin-induced neurovascular protection,angiogenesis,and cerebral blood flow restoration after focal ischemia in mice[J].J Cereb Blood Flow Metab,2007,27(5):1043-1054.

[3]Rabie T,Marti HH.Brain protection by erythropoietin:A manifold task[J].Physiology,2008,23:263-274.

[4]Liu R,Suzuki A,Guo Z,et al.Intrinsic and extrinsic erythropoietin enhances neuroprotection against ischemia and reperfusion in jury in vitro[J].J Neurochem,2006,96(4):1101-1110.

[5]侯紅梅，董文斌.促紅細胞生成素與腦保護[J].國外醫(yī)學.神經病學神經外科學分冊，2004，31(5)：494-497.

[6]Ghezzi P,Brines M.Erythropoietin as an antiapoptotic,tissue-protective cytokine[J].Cell Death Differ,2004,11 Suppl 1:37-44.

[7]Wiese L,Hempel C,Penkowa M,et al.Recombinant human erythropoietin increases survival and reduces neuronal apoptosis in a murine model of cerebral malaria [J].Malar J,2008,7(2):3-11.

[8]Liao ZB,Jiang GY,Tang ZH,et al.Erythropoietin can promote survival of cerebral cells by downregulating Bax gene after traumatic brain injury in rats[J].Neurol India,2009,57(6):722-728.

[9]Kato S,Amano H,Ito Y,et al.Effect of erythropoietin on angiogenesis with the increased adhesion of platelets to the microvessels in the hind-limb ischemia model in mice[J].J Pharmacol Sci,2010,112(2):167-175.

[10]Sharples EJ,Christoph T,Yaqoob MM.Novel applications of recombinant erythropoietin[J].Curr Opin Pharmacol,2006,6(2):184-189.

[11]Kilic E,Kilic U,Soliz J,et al.Brain-derived erythropoietin protects from focal cerebral ischemia by dual activation of ERK-1/-2 and Akt pathways[J].FASEB J,2005,19(14):2026-2028.

[12]Eid T,Brines M.Recombinant human erythropoietin for neuroprotection:what is the evidence [J].Clin Breast Cancer,2002,3 Suppl 3:S109-115.