陳小菊，王濤

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 南充 637000)

酪氨酸激酶受體RON在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺內(nèi)表達的研究

陳小菊，王濤

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 南充 637000)

目的:探討酪氨酸激酶受體RON在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)大鼠氣道炎癥中的作用。方法:單純熏香煙法建立COPD大鼠模型;支氣管肺泡灌洗計數(shù)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞總數(shù)與肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage，AM)數(shù)，培養(yǎng)正常和COPD大鼠AM，采用逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測大鼠肺組織中酪氨酸激酶受體RON mRNA的表達情況，免疫組化法觀察大鼠氣道和離體培養(yǎng)的AM中RON蛋白的表達水平，圖像分析系統(tǒng)測定肺平均內(nèi)襯間隔(MLI)、平均肺泡數(shù)(MAN)和肺泡腔面積與總面積比(PAA)。結(jié)果:COPD組MLI、PAA較正常對照組明顯增高［MLI:(111.451±49.334)×10－6m vs(44.803±10.624)×10－6m;PAA:(79.653±7.594)%vs(48.352±13.063)%］，而MAN則明顯低于正常對照組［(81.621±20.394)×106/m2vs(170.098±42.398)×106/m2］，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。COPD組BALF中細胞總數(shù)和AM計數(shù)均明顯高于正常對照組［細胞總數(shù):(6.029±0.420)×108/L vs(1.463±0.0692)×108/L;AM數(shù):(5.752±0.571)×108/L vs(1.387±0.105)×108/L，P＜0.01)］。COPD組大鼠肺組織RON mRNA表達較正常對照組明顯上調(diào)［(0.892±0.088)vs(0.353±0.080)，P＜0.01］，COPD組大鼠氣道上皮及AM中RON蛋白水平也較正常對照組顯著增加［氣道RON蛋白:(0.171±0.027)vs(0.073±0.009);AM RON蛋白:(0.310±0.101)vs(0.110±0.006)，P＜0.01］。結(jié)論:RON與COPD氣道炎癥調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

酪氨酸激酶受體RON;慢性阻塞性肺疾病;肺泡巨噬細胞

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，其發(fā)病率和死亡率均逐年增加，嚴(yán)重威脅人類健康。COPD的主要特征是慢性進行性的不可逆氣流受限，氣道的慢性炎癥是其重要的病理學(xué)基礎(chǔ)之一。有研究表明［1］，肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage，AM)及其釋放的細胞因子和氧化應(yīng)激在其中起重要作用。RON為酪氨酸激酶受體家族中的一員，是一種細胞膜受體蛋白，具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性，其配體為巨噬細胞刺激蛋白(macrophage stimulating protein，MSP)。RON和MSP結(jié)合后能刺激巨噬細胞產(chǎn)生氧自由基和細胞因子、誘導(dǎo)NF-κB的活化，調(diào)節(jié)細胞分化、遷移和基質(zhì)的侵襲等功能［2－3］。Brunelleschi等［4］發(fā)現(xiàn)，肺癌、肺纖維化及肺結(jié)節(jié)病患者的AM表面有酪氨酸激酶受體RON表達，其在MSP介導(dǎo)下能誘導(dǎo)巨噬細胞的呼吸爆發(fā)。但RON在COPD中的作用，目前尚未見到相關(guān)報道。本研究通過煙熏3月建立COPD大鼠模型，分離培養(yǎng)正常和COPD大鼠的AM，檢測正常組和COPD組大鼠肺組織中酪氨酸激酶受體RON mRNA的表達情況、兩組大鼠氣道上皮和培養(yǎng)的AM中RON蛋白的表達水平，旨在進一步探討RON在COPD炎性機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料和對象

1.1.1 試劑瑞氏-姬姆薩復(fù)合染液(南京建成科技有限公司);低糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司);胎牛血清(Hyclone公司);引物合成(上海生工生物技術(shù)公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(成都博瑞克生物技術(shù)有限公司);PCR反應(yīng)體系(天根生物技術(shù)有限公司);RONβ(E-3)鼠抗人單克隆抗體(SANTA公司);RON免疫組化試劑盒(Neobioscience公司)。紅梅牌香煙(玉溪卷煙廠，焦油12mg、煙堿1.1 mg、煙氣CO含量13 mg)。

1.1.2 實驗動物清潔級健康Wistar大鼠16只，雄性，體重(190±10)g，由川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，符合SPF級別標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.3 實驗儀器鴿牌TDL5A離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)、DHP420型電熱恒溫培養(yǎng)箱(重慶永恒實驗儀器廠)、OLYMPUS DP70(日本OLYMPUS公司)、Mycyder梯度PCR儀(美國BIO-RAD公司)，HC型凝膠電泳儀(美國BIO-RAD公司)，Multi-Heater2800A多用恒溫箱(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。Heal Force二氧化碳培養(yǎng)箱HF90(力康生物醫(yī)療科技控股公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 COPD大鼠模型的建立及動物分組16只Wistar大鼠隨機分為正常對照組和COPD組，每組8只。兩組大鼠均自由飲水進食，將COPD組大鼠放入大小為60 cm×60 cm×35 cm自制有機玻璃煙熏箱內(nèi)被動吸煙。每次燃燒10支香煙，每天1次，每次1 h，連續(xù)3個月至病理證實COPD形成。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗和支氣管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid，BALF)細胞學(xué)檢查大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，暴露氣管和雙肺，夾閉右主支氣管，用37℃生理鹽水15 mL分4次灌洗左肺。每次灌洗液回收率為90%～95%。將所得灌洗液用單層無菌200目細胞篩過濾，收集全部灌洗液，4℃、1500 r/min離心5 min，細胞沉淀用PBS洗滌后加入含10%胎牛血清、50 μg/mL鏈霉素和5 U/mL青霉素的無酚紅DMEM(低糖)培養(yǎng)液重懸沉淀制成單細胞懸液，瑞氏－姬姆薩復(fù)合染液染色進行細胞計數(shù)(至少計數(shù)200個細胞)，并用臺盼藍檢測細胞活力。AM的純度始終＞95%，存活率＞98%。

1.2.3 AM的培養(yǎng)及處理進行細胞計數(shù)和檢測細胞活力后，調(diào)整細胞密度為1×109個/L，將其接種于放置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，純化培養(yǎng)2 h使細胞貼壁，然后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸走所有細胞上清液，用PBS洗板，4%多聚甲醛室溫固定，取出蓋玻片，PBS漂洗2次，自然風(fēng)干后用錫泊紙包好保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 肺組織標(biāo)本制備取大鼠左肺置于液氮中，用于RNA提取。取大鼠右肺置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋切片，每只大鼠準(zhǔn)備兩張切片分別作HE和免疫組化染色。

1.2.5 病理學(xué)形態(tài)定量分析在OLYMPUS DP70顯微鏡下觀察大鼠HE染色切片，使顯微鏡處于同一放大倍數(shù)(10×20)及電壓下，每張切片均選取上、中、下、左、右5個視野，用DP Controller軟件進行圖像采集，IMAGE-PRO plus 6.0圖文分析軟件分別測量下列3個指標(biāo)，測量時避開大、中血管。

肺平均內(nèi)襯間隔(MLI):以視野正中為中心劃“十”字交叉線，計數(shù)通過該交叉線的肺泡間隔數(shù)(Ns)，測出十字線的總長度(L)為1.253×10－3m，以MLI=L/Ns得到平均內(nèi)襯間隔，其數(shù)值反映肺泡平均直徑。

平均肺泡數(shù)(MAN):計數(shù)每個視野內(nèi)的肺泡數(shù)(Na)，測出每個視野的面積(S)為0.54×10－6m2。以MAN=Na/S計算各個視野的平均肺泡數(shù)，其數(shù)值反映肺泡密度。

肺泡腔面積與總面積比(PAA):測量每個視野內(nèi)的肺實質(zhì)的灰度百分比，計算出每個視野中肺泡腔面積在肺總面積中所占的比例。

1.2.6 RON mRNA的檢測采用RT-PCR法檢測大鼠肺組織中RON mRNA的表達，內(nèi)參照為甘油醛-3-磷酸脫氫酶。引物序列:RON上游引物:5-GAGAGCCTTCAGACCTACAGA-3'，下游引物:5'-TTGACGTGCTCCTGTGATGCA-3'，擴增片段長度400 bp。GAPDH上游引物:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物:5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，擴增片段長度450 bp。

1.2.7 免疫組化染色AM細胞爬片及肺組織切片的免疫組化染色均采用鏈親和素過氧化物酶法(SP法)，檢測按試劑盒說明書進行。RONβ(E-3)鼠抗人單克隆抗體工作濃度為1∶20。組織切片需熱修復(fù)抗原。采用DAB顯色，蘇木素套染，陽性結(jié)果呈棕黃色。

在OLYMPUS DP70顯微鏡高倍鏡視野下，每張免疫組化染色切片或細胞爬片隨機不重復(fù)采圖5張，應(yīng)用IMAGE-PRO plus 6.0圖文分析軟件測量每張圖片的平均光密度值，再取其平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 實驗結(jié)果

2.1 兩組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變

大體形態(tài)觀察可見:COPD模型組大鼠肺體積比正常對照組明顯增大，顏色蒼白，彈性減弱，肺表面不平，可見小囊泡狀突起，表面無出血，無液體滲出。光鏡觀察可見:正常對照組氣管及各級支氣管粘膜纖毛柱狀上皮細胞完整豐富，纖毛排列整齊，纖毛細胞間僅見散在的杯狀細胞，管壁內(nèi)有少量淋巴細胞。COPD組大鼠氣管及各級支氣管可見不同程度的慢性炎癥細胞(包括淋巴細胞、漿細胞及單核細胞)和少量中性粒細胞浸潤。支氣管纖毛上皮細胞變性、壞死、脫落。杯狀細胞明顯增多，胞體增大，內(nèi)含豐富的粘蛋白顆粒。支氣管平滑肌增厚。管腔內(nèi)有較多的分泌物以及巨噬細胞和中性粒細胞，周邊肺組織普遍存在肺氣腫，表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、肺泡壁變薄或斷裂、肺泡腔擴大，部分融合成肺大皰。結(jié)果，見圖1。

2.2 肺氣腫形態(tài)學(xué)定量分析

COPD組的MLI和PAA顯著高于正常對照組，MAN顯著低于正常對照組，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)，結(jié)果見表1。

表1 兩組大鼠肺氣腫形態(tài)學(xué)定量指標(biāo)±s)

表1 兩組大鼠肺氣腫形態(tài)學(xué)定量指標(biāo)±s)

*:P＜0.01，與正常對照組比較。

正常對照組844.803±10.624170.098±42.39848.352±13.063 COPD組8111.451±49.334*81.621±20.394*79.653±7.594*

2.3 兩組大鼠BALF中細胞總數(shù)和AM計數(shù)

COPD組大鼠BALF中細胞總數(shù)和AM計數(shù)顯著高于正常對照組(P＜0.01)，結(jié)果見表2。

表2 兩組大鼠BALF中細胞總數(shù)和AM計數(shù)±s)

表2 兩組大鼠BALF中細胞總數(shù)和AM計數(shù)±s)

*:P＜0.01，與正常對照組比較。

正常對照組81.463±0.06921.387±0.105 COPD組86.029±0.420*5.752±0.571*

2.4 兩組大鼠肺組織RON mRNA的表達

COPD組大鼠肺組織RON mRNA的表達顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，結(jié)果見表3和圖2。

表3 大鼠肺組織RON mRNA、氣道RON蛋白及AMRON蛋白表達±s)

表3 大鼠肺組織RON mRNA、氣道RON蛋白及AMRON蛋白表達±s)

*:P＜0.01，與正常對照組比較。

正常對照組80.353±0.0800.110±0.0060.073±0.009 COPD組80.892±0.088*0.310±0.101*0.171±0.027*

2.5 兩組大鼠AM和氣道上皮中RON蛋白的表達

免疫組化顯示:正常和COPD組大鼠氣道纖毛上皮和AM中均有RON蛋白表達，正常大鼠氣道纖毛上皮層僅見其纖毛頂端表面有RON蛋白表達，而COPD大鼠氣道纖毛上皮胞漿和纖毛頂端均可見RON蛋白表達。在正常大鼠AM中RON蛋白主要表達在細胞胞膜上，而COPD大鼠AM胞膜和胞漿中均有RON蛋白表達。統(tǒng)計分析顯示:COPD組大鼠氣道上皮和AM中RON蛋白表達明顯強于正常組大鼠(P＜0.01)，見表3，圖3、圖4。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn):COPD模型組大鼠肺體積比正常對照組明顯增大，顏色蒼白，彈性減弱，肺表面不平，可見小囊泡狀突起，提示肺氣腫形成。進一步光鏡觀察可見:COPD組大鼠氣管及各級支氣管可見不同程度的慢性炎癥細胞(包括淋巴細胞、漿細胞及單核細胞)和少量中性粒細胞浸潤;支氣管纖毛上皮細胞變性、壞死、脫落;杯狀細胞明顯增多，胞體增大，內(nèi)含豐富的粘蛋白顆粒;支氣管平滑肌增厚;管腔內(nèi)有較多的分泌物以及巨噬細胞和中性粒細胞;肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、肺泡壁變薄或斷裂、肺泡腔擴大，部分融合成肺大皰。上述改變符合COPD的形態(tài)學(xué)診斷指標(biāo)。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)，COPD組大鼠MLI、PAA較正常對照組明顯增高，而MAN則明顯低于正常對照組。提示COPD組大鼠肺泡平均直徑和肺泡腔面積在肺總面積中所占比例明顯高于正常對照組，而肺泡密度則明顯低于正常對照組。說明COPD模型組肺氣腫的病理學(xué)診斷成立，表明本實驗單純熏香煙法制備的COPD動物模型是成功的。

現(xiàn)己公認(rèn)吸煙是COPD的最主要危險因素，約15%的長期吸煙者發(fā)生COPD。有資料表明，吸煙者下呼吸道內(nèi)炎性細胞數(shù)目明顯增多［5］，其中AM數(shù)目在吸煙者和COPD患者的BALF中升高達數(shù)倍以上。本實驗研究也證實COPD組大鼠BALF中細胞總數(shù)和AM計數(shù)顯著高于正常對照組，與其它報道結(jié)果一致［6］。再次證實了在COPD的氣道腔中存在著以AM增多為特征的慢性非特異性炎癥。

RON是MSP的特異性受體，其基因位于人類染色體3p21，含有20個外顯子和19個內(nèi)含子。成熟的RON蛋白是由α和β亞單位組成的雜二聚體，α鏈和β鏈之間由二硫鍵相連［7－8］，其基因在人體上皮組織、粒細胞、單核細胞、巨噬細胞以及扁桃體生發(fā)層、小腸、結(jié)腸、腎臟、肺、骨髓中都有表達［9］;人纖毛上皮如氣管支氣管上皮層纖毛頂端表面亦發(fā)現(xiàn)了RON蛋白的表達［10］。本實驗免疫組化結(jié)果顯示:正常和COPD組大鼠氣道纖毛上皮和AM中均有RON蛋白表達，正常大鼠氣道纖毛上皮層僅見其纖毛頂端表面有RON蛋白表達，與文獻報道一致;而COPD大鼠氣道纖毛上皮胞漿和纖毛頂端均可見RON蛋白表達。在正常大鼠AM中RON蛋白主要表達在細胞胞膜上，而COPD大鼠AM細胞胞膜和胞漿中均有RON蛋白表達。統(tǒng)計分析顯示:COPD組大鼠氣道纖毛上皮和AM細胞中RON蛋白的表達明顯強于正常對照組。PCR結(jié)果顯示:COPD組大鼠肺組織RON mRNA的表達也明顯強于正常對照組。因此，我們推測RON在COPD氣道炎癥中起較為重要的作用，其詳細機制有待進一步研究。

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The expression of receptor tyrosine kinase RON in lung tissue of rats with chronic obstructive pulmonary disease

CHEN Xiao-ju，WANG Tao
(Department of Respiratory Medicine，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China)

Objective:To explore the role of receptor tyrosine kinase RON in the airway inflammation of chronic obstructive pulmonary disease(COPD)in rats.MethodsA rat COPD model was established by exposing the rats to cigarette smoke daily for three mouth.Total cell counts and alveolar macrophage(AM)counts in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were examined.Rat AMs from the control group and COPD group were cultured.The expression of RON mRNA in lung tissue of rats was assessed by reverse transcription－polymerase chain reaction(RT-PCR).The levels of RON protein in the airway of rats and AM cultured in vitro were observed by immuno－h(huán)istochemistry.ResultsThe MLI and PAA in COPD group were higher than those of the control group while MAN was just on the contrary(P＜0.01).The total cell counts and AM counts in BALF of the COPD group were significantly higher than those of control group(P＜0.01).Compared to the control group，the levels of RON mRNA in lung tissue from COPD rats were up-regulated significantly(P＜0.01).The levels of RON protein in the COPD rats airway and AM were higher than those of control group signifi-cantly(P＜0.01).ConclusionThere is a close correlation between RON and airway inflammatory mechanism of COPD.

Tyrosine kinase receptor RON;Chronic obstructive pulmonary disease;Alveolar macrophages

1005-3697(2012)04-0355-05

R734.2;R563.9

A

10.3969/j.issn.1005-3697.2012.04.014

四川省衛(wèi)生廳科研項目(070293)

2012-04-09

陳小菊(1971－)，四川岳池人，博士，副教授，主要從事慢性阻塞性肺疾病和肺動脈高壓發(fā)病機制方面的研究工作。E-mail:cxj9592@163.com

時間:2012-7-80∶29

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20120708.0029.201204.352_013.html

(學(xué)術(shù)編輯:陳紹平)