陳鈺，宋思維，邱敏，吳稚偉

(南京大學醫(yī)學院公共健康醫(yī)學中心，江蘇南京 210093)

人類單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV-2)是生殖器皰疹的病原體，其感染人體后易潛伏在骶神經(jīng)根區(qū)，在一定條件下受到激活后，臨床主要表現(xiàn)為生殖器周圍出現(xiàn)疼痛性皰疹，反復發(fā)作，難以治愈，為感染率最高的性傳播疾病之一。目前研究表明，HSV-2和HIV-1感染具有協(xié)同作用，HSV-2感染引起的開放性損傷和生殖道局部炎癥可使感染HIV-1的危險性增加，預防和治療HSV-2的感染非常重要。目前市售治療HSV-2感染的藥物共50多種，主要為核苷類化合物，主要作用于阻斷病毒建立感染后的復制過程。而預防性藥物未見于市面，故開發(fā)新的阻斷病毒侵入預防性藥物變得尤為重要。本研究探索4-苯乙烯磺酸馬來酸酐共聚物(PSM)［1-2］這一常用阻垢劑的共聚化合物對HSV-2病毒感染細胞和小鼠的作用，評估其在體內(nèi)和體外的抗病毒效果。

1 材料與方法

1． 1 材料

1．1．1 細胞和病毒 Vero(非洲綠猴腎細胞)、293T、HEC-1-A(人子宮內(nèi)膜癌細胞)均購自ATCC。HSV-2(G)(實驗室適應株)由南京大學李爾廣教授饋贈。

1．1．2 動物與分組 BALB/c小鼠，雌性，共40只，體重(15±2)g，購自揚州大學比較醫(yī)學中心。隨機將小鼠平均編入實驗組和對照組。

1．1．3 主要試劑 PSM購自Sigma公司;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司;pGL4質(zhì)粒、Luciferase檢測試劑盒購自Promega公司;HSV-1/2 gD蛋白抗體及β-catenin蛋白抗體購自 Santa Cruz公司;Depo-Provera購自Pfizer公司;熒光二抗購自Odyssey公司。

1． 2 方法

1．2．1 病毒的增殖和滴定 在293T細胞中接種約107pfu HSV-2(G)，48 h后轉(zhuǎn)移1 ml上清到另一皿293T細胞中，重復3～5次后獲得毒力較高的HSV-2(G)。接種5×104個·孔－1Vero細胞至96孔細胞培養(yǎng)板進行培養(yǎng)，待細胞貼壁后依次加入50 μl病毒原液及以 培養(yǎng)基 稀 釋至 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7的病毒液，共計 8 個濃度梯度，48 h 后在Vero細胞上觀察空斑數(shù)計算病毒滴度。

1．2．2 Vero-ICP10細胞系的建立 通過 PCR擴增HSV-2的ICP10［3］啟動子目的基因片段，其中使用的PCR上游引物為5'GGGGTACCGTCGACAGGCTGTAC3'，下游引物為5'CCCAAGCTTGTCGACAGGACAGC3'，測序正確后通過KpnⅠ和HindⅢ雙酶切克隆至熒光素酶報告質(zhì)粒pGL4中構建重組質(zhì)粒pGL4-ICP10-Promoter。使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染Vero細胞，經(jīng)G418篩選并通過有限稀釋法獲得單克隆，即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株Vero-ICP10-Promoter，按照Luciferase檢測試劑盒說明書操作檢測熒光素酶活性。

1．2．3 細胞給藥方式 在96孔板中接種單層Vero細胞或者HEC-1-A細胞，待細胞生長到90%以上融合后，分別加入濃度梯度為 60、20、6．67、2．2、0．74、0．25、0．08 μg·ml－1的 PSM 溶液100 μl，在對照組中加入100 μl DMEM培養(yǎng)基，混勻后均加入50 μl HSV-2(G)(MOI=1)病毒溶液。

1．2．4 In cell western測定gD蛋白表達 給藥24 h后，移去96孔板中的培養(yǎng)基并用PBS洗滌去除細胞表面病毒，每孔加入預冷的4%多聚甲醛溶液固定細胞20 min后用0．1%Triton X-100緩沖液對固定的細胞進行穿孔。使用含Odyssey blocking buffer室溫對細胞封閉1 h，每孔加入50 μl含 HSV-1/2 gD蛋白抗體［4］及 β-catenin 蛋白抗體(1∶200)的 blocking buffer于室溫靜置2 h后，用PBST緩沖液洗滌3次，每次5 min，每孔再加入稀釋2 000倍的紅外熒光二抗各50 μl，室溫振蕩 1 h后再用 PBST洗液3次，每次5 min，吸干殘余水分后，使用 Odyssey系統(tǒng)進行700 nm和800 nm兩個通道同時掃描。所得圖像使用Odyssey 2．1軟件進行數(shù)據(jù)化處理，計算其熒光強度。所有實驗組都設置2個復孔。

1．2．5 HSV-2陰道感染小鼠模型建立 使用Depo-ProveraTM預處理使小鼠進入動情周期并對HSV-2易感。對照組將10 μl安慰劑(花生油)預注入小鼠陰道子宮處［5-6］，待其吸收后注入 8 μl的 HSV-2(G)病毒懸液(5×105pfu)。實驗組小鼠使用10 μl濃度為5%的PSM(該共聚物的交聯(lián)濃度)預注入小鼠陰道子宮處，待其吸收后注入等劑量的HSV-2(G)病毒懸液。觀察對比兩組14 d內(nèi)感染情況。

1． 3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2． 1 構建Vero-ICP10-promotor細胞系

通過PCR成功獲得ICP10-promotor區(qū)DNA，雙酶切后連接至pGL4載體并轉(zhuǎn)化TOPO10感受態(tài)細胞，篩選獲得陽性克隆，提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染Vero細胞，并成功通過G418篩選出單克隆細胞株，經(jīng)Luciferase檢測能夠在激活ICP10-promotor時表現(xiàn)出一定的熒光強度。構建質(zhì)粒流程見圖1。

圖1 質(zhì)粒構建流程圖Fig 1 The construction of pGL4-ICP10-Promotor

2． 2 PSM對HSV-2感染Vero細胞ICP10啟動子表達的影響

在96孔板中接種適當密度的構建成功的Vero-ICP10-promotor細胞，給藥24 h后測定熒光素酶活性［7］，取3個復孔的平均值，與僅加入HSV-2(PSM濃度為0)的熒光強度相對比，結(jié)果見圖2。ICP10啟動子激活程度越高，熒光素酶強度越高，說明HSV-2感染越嚴重。由圖2可見，PSM給藥濃度為60～2．22 μg·ml－1時，均能有效抑制 HSV-2 感染，而濃度較低時對HSV-2感染失去抑制作用。

圖2 PSM給藥濃度與相對熒光強度間關系Fig 2 The relationship between the concentraions of PSM and the relative fluorescence intensity of Luciferase

2． 3 PSM對HSV-2gD蛋白表達的影響

在96孔板中接種適當密度的HEC-1-A細胞，給藥后24 h通過In cell western測定病毒gD蛋白(鼠抗，見Odyssey 800 nm通道掃描結(jié)果，熒光呈綠色)和內(nèi)參β-catenin蛋白(兔抗，見Odyssey 700nm通道掃描結(jié)果，熒光呈紅色)的表達情況(圖3)，通過內(nèi)參校正，比較不同濃度給藥后對病毒復制的影響。由圖3可見，在HEC-1-A細胞中，PSM對HSV-2感染的抑制作用呈一定劑量依賴性，且當PSM濃度為60～0．74 μg·ml－1時，效果均較顯著，而在濃度較低時，也具備一定抗病毒作用。

圖3 PSM給藥濃度和gD蛋白表達間的關系Fig 3 The relationship between the concentraions of PSM and the expression of HSV-2 gD

2． 4 PSM對HSV-2感染小鼠的影響

觀察小鼠14 d內(nèi)是否存在發(fā)病癥狀，如陰道口出現(xiàn)顯著紅腫或者死亡等。對照組20只小鼠從感染第6天開始，共有17只陰道口顯著紅腫，2只死亡，表明HSV-2感染小鼠模型構建成功，而實驗組20只小鼠則只有1只陰道口出現(xiàn)顯著紅腫現(xiàn)象。對照組小鼠感染率為95%，實驗組為5%，兩組感染率差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0．001)，表明PSM對HSV-2感染小鼠有顯著抑制作用。

3 討 論

Vero細胞最初起源于非洲綠猴腎，為HSV-2易感細胞，常用其進行病毒滴度測定;HEC-1-A細胞是人子宮內(nèi)膜細胞，由于HSV-2感染常位于生殖器部位，而女性的感染常由陰道部位開始，故使用HEC-1-A細胞對HSV-2感染內(nèi)膜細胞進行評估。

ICP10是核糖核酸轉(zhuǎn)移酶大亞基的啟動子，屬于病毒編碼的早期基因，通過和熒光報告素酶的連接，可以用于檢測病毒的感染。通過Vero-ICP10-Promotor細胞系的構建，能根據(jù)熒光報告素酶的強度表明在加入HSV-2病毒24 h后ICP10啟動子的激活程度，提示HSV-2感染細胞的能力。gD蛋白是HSV-2包膜糖蛋白中的一種，是病毒穿膜的關鍵蛋白之一，同時gD也是主要的抗原物質(zhì)，而In cell western能檢測出gD蛋白的表達［8-9］，從而進行HSV-2感染的定量。這兩個細胞學實驗證實了PSM具有抗HSV-2的作用，而兩實驗中PSM的抑制效果不同可能是由于細胞品系不同、敏感性不同而造成的。而通過成功構建HSV-2感染小鼠模型，更證實了PSM在動物感染模型也具有抗HSV-2 的作用［10］。

本實驗中PSM能夠有效抑制HSV-2(G)感染Vero細胞以及HEC-1-A細胞，其作用強度表現(xiàn)為在一定濃度范圍內(nèi)有效，呈劑量依賴性，而相關機制方面的研究還需進行實驗探索。按其化學結(jié)構以及相關文獻報道推測，可能是由于其能在細胞表面形成保護，從而抑制病毒感染細胞［11］，這需要進一步實驗證明。

［1］ANDERSON R A，F(xiàn)EATHERGILL K，DIAO X，et al．Evaluation of poly(styrene-4-sulfonate)as a preventive agent for conception and sexually transmitted diseases［J］．Androl，2000，21:862-875．

［2］BABA M，NAKAJIMA M，SCHOLS D，et al．Pentosan polysulfate，a sulfated oligosaccharide，is a potent and selective anti-HIV agent in vitro［J］．Antiviral Res，1988，9(6):335-343．

［3］ZHU J，AURELIAN L．AP-1 cis-response elements are involved in basal expression and Vmw 110 transactivation of the large subunit of herpes simplex virus type 2 ribonucleotide reductase(ICP10)［J］．Virology，1997，231(2):301-312．

［4］KOELLE D M，COREY L．Recent progress in herpes simplex virus immunobiology and vaccine research［J］．Clin Microbiol Rev，2003，16:96-113．

［5］GILLGRASS A E，ASHKAR A A，ROSENTHAL K L，et al．Prolonged exposure to progesterone prevents induction of protective mucosal responses following intravaginal immunization with attenuated herpes simplex virus type 2［J］．J Virol，2003，77:9845-9851．

［6］LEKSTROM-HIMES J A，WANG K，PESNICAK L，et al．The comparative biology of latent herpes simplex virus type 1 and type 2 infections:latency-associated transcript promoter activity and expression in vitro and in infected mice［J］．J Neurovirol，1998，4(1):27-37．

［7］丁潔，周靜，袁榴娣．果蠅S2細胞中高表達熒光素酶重組質(zhì)粒的構建及活性測定［J］．東南大學學報:醫(yī)學版，2006，25(6):403-406．

［8］EGORINA E M，SOVERSHAEV M A，OSTERUD B．In cell western assay:a new approach to visualize tissue factor in human monocytes［J］．J Thromb Haemost，2006，4(3):614-620．

［9］MCLEAN C S，ERTURK M，JENNINGS R，et al．Protective vaccination against primary and recurrent disease caused by herpes simplex virus(HSV)type-2 using a genetically disabled HSV-1［J］．Infect Dis，1994，170:1100-1109．

［10］劉慶芝，姚吉龍，都紅蕾，等．全反式維甲酸對裸鼠子宮內(nèi)膜癌治療作用的實驗研究［J］．東南大學學報:醫(yī)學版，2011，30(2):278-282．

［11］ZHU J，HLADIK F，WOODWARD A，et al．Persistence of HIV-1 receptor-positive cells after HSV-2 reactivation is a potential mechanism for increased HIV-1 acquisition［J］．Nature Medicine，2009，15:886-892．