王 萌,向極釬，汪李平,殷紅清,馬 進(jìn)

(1.恩施清江生物工程有限公司，湖北 恩施 445000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

根用芥菜(Brassicajunceavar.megarrhizaTsen et Lee)又名大頭菜，屬我國(guó)特產(chǎn)蔬菜.我國(guó)大頭菜育種相對(duì)比較落后，嚴(yán)重地制約著生產(chǎn)的發(fā)展.利用花藥培養(yǎng)技術(shù)可以加速育種進(jìn)程.花藥培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展迅速,特別是在十字花科作物上，已成為重要的育種手段，而在根用芥菜上，相關(guān)的研究很少[1-2].

本研究旨在探索根用芥菜花藥培養(yǎng)過(guò)程中最適培養(yǎng)基、激素、預(yù)冷時(shí)間、熱激時(shí)間等，建立其較為完善的花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)體系，從而獲得DH系，加速育種進(jìn)程.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以著名地方品種-襄樊獅子頭芥菜(大頭菜)為材料.采取常規(guī)栽培管理，株現(xiàn)蕾后，摘取健壯無(wú)病蟲的花蕾進(jìn)行試驗(yàn).丟棄有病、有蟲、畸形、開裂、柱頭外露的花蕾，去除過(guò)大和過(guò)小的花蕾，花序上僅保留2.0～3.0 mm長(zhǎng)度的花蕾(小孢子處于單核靠邊期見封二圖版4).將處理好的花序用濕紗布包裹放入培養(yǎng)皿中，置于4℃冰箱.

1.2 試驗(yàn)方法

將處理好的花序先在自來(lái)水下沖洗30 min，在超凈工作臺(tái)上，依次使用 75%的酒精滅菌30 s，0.1%的升汞滅菌10 min，無(wú)菌水清洗3次.在無(wú)菌濾紙上用尖頭鑷子輕輕剝開花蕾，取出花藥，接種于培養(yǎng)基上，蓋上培養(yǎng)皿，用parafilm膜封口.剝?nèi)』ㄋ帟r(shí)要盡量少傷及花藥，盡量不要帶花絲.在隔水式恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行熱激處理一定的時(shí)間后，轉(zhuǎn)入25℃條件下黑暗靜置培養(yǎng)，4周后統(tǒng)計(jì)胚狀體誘導(dǎo)率.培養(yǎng)基瓊脂含量為0.8%，pH5.8，121℃高溫濕熱滅菌[3].

1.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)出胚率的影響 不同的培養(yǎng)基在花藥培養(yǎng)試驗(yàn)中報(bào)道結(jié)果不一，而且花藥培養(yǎng)成功的報(bào)道相對(duì)較多.而在大頭菜游離小孢子培養(yǎng)上報(bào)道較少，花藥培養(yǎng)尚未見報(bào)道.所以本實(shí)驗(yàn)選用在十字花科作物上使用較多的MS、B5和改良的Keller培養(yǎng)基[4-6].其中MS、B5的蔗糖濃度為6%，改良Keller蔗糖濃度為10%[7].

1.2.2 激素對(duì)出胚率的影響 將花藥接種于添加1 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的Keller-10培養(yǎng)基中，以不添加激素的Keller-10為對(duì)照[8]，4周后統(tǒng)計(jì)不同處理間胚狀體誘導(dǎo)率的差異.

1.2.3 預(yù)冷天數(shù)對(duì)出胚率的影響 將挑選好的花序用濕紗布包好放入4℃的冰箱進(jìn)行預(yù)冷處理，處理天數(shù)分別為0、1、3、5 d，達(dá)到預(yù)定時(shí)間后取出進(jìn)行花藥培養(yǎng)，以不進(jìn)行預(yù)冷處理為對(duì)照.

1.2.4 熱激天數(shù)對(duì)出胚率的影響 花藥接種后放入32.5℃恒溫箱中進(jìn)行熱激處理，熱激處理處理時(shí)間分別為0、1、2 d，處理結(jié)束后轉(zhuǎn)入25℃恒溫箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng).

上述試驗(yàn)的每個(gè)處理中，平均每個(gè)培養(yǎng)皿接種4個(gè)花蕾，每個(gè)處理10皿，兩次重復(fù).

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)花藥胚胎發(fā)生的影響

表2 激素對(duì)花藥胚胎發(fā)生的影響

表3 預(yù)冷天數(shù)對(duì)花藥胚胎發(fā)生的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對(duì)出胚率的影響

本試驗(yàn)中，MS-6和B5-6兩種培養(yǎng)基上沒有獲得胚狀體，由表1得出結(jié)論，Keller-10培養(yǎng)基更適合進(jìn)行大頭菜的花藥培養(yǎng).實(shí)驗(yàn)中我們觀察到，當(dāng)花藥從花蕾中剝出時(shí)，花藥呈黃綠色，接種后3 d左右，花藥變?yōu)榱咙S色，稍微膨大，多數(shù)花藥有明顯的彎曲現(xiàn)象；隨后花藥的顏色慢慢變?yōu)辄S褐色至褐色.大約3周后，某些花藥上會(huì)有白色的針狀物刺破花藥壁鉆出，這些就是子葉胚的雛形，子葉胚自胚根伸出后發(fā)育較快，約一周的時(shí)間就可看到完整的子葉胚(見封二圖版5).

2.2 激素對(duì)出胚率的影響

由表2可以得出在添加激素的培養(yǎng)基中無(wú)胚狀體產(chǎn)生，Keller-10培養(yǎng)基不添加激素更適合進(jìn)行大頭菜花藥培養(yǎng).在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，添加激素的培養(yǎng)基中，帶有花絲的花藥多數(shù)都有膨大現(xiàn)象，另外，在花藥上特別是花藥與花絲的斷口處，常常形成一團(tuán)白色半透明的愈傷組織，在接種的初期，愈傷生長(zhǎng)很快，到后期慢慢褐化死亡.

2.3 預(yù)冷天數(shù)對(duì)出胚率的影響

由表3可以得出4℃處理5 d與處理3 d在對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)上存在顯著差異，處理5 d的誘導(dǎo)率最低，預(yù)冷0、1、3 d三種處理之間在出胚總數(shù)和出胚率上存在差異，但是這種差異沒有達(dá)到顯著水平，所以4℃低溫處理花序0、1、3 d都有較好的出胚率，低溫處理3 d時(shí)，出胚率最高.

2.4 熱激天數(shù)對(duì)出胚率的影響

熱激處理的目的在于從外界給予花藥內(nèi)的小孢子一種刺激，促使它的發(fā)育途徑偏轉(zhuǎn)，由配子體發(fā)育轉(zhuǎn)到孢子體發(fā)育途徑上.在不同的物種，不同的種、品種間最適的熱激的時(shí)間都不太一致，但多數(shù)認(rèn)為熱激處理是有效的.由表4可以看出，在本試驗(yàn)中也得出相似的結(jié)論，32.5℃熱激處理1、2 d與不進(jìn)行熱激處理之間在出胚誘導(dǎo)上存在顯著差異，熱激處理1 d和2 d之間沒有顯著差異，但熱激處理2 d稍好.

表4 熱激天數(shù)對(duì)花藥胚胎發(fā)生的影響

3 結(jié)論與討論

通過(guò)比較MS、B5和改良Keller三種培養(yǎng)基對(duì)出胚率的影響，得出改良Keller更適合根用芥菜花藥培養(yǎng).在試驗(yàn)中觀察到MS-6和B5-6培養(yǎng)基上接種的花藥與在Keller-10上培養(yǎng)的花藥相比，沒有明顯的不同，這可能是花藥內(nèi)的小孢子沒有脫分化或者脫分化后發(fā)育在某個(gè)階段停止，沒有刺破花藥壁鉆出.另外還觀察到如果接種的花藥帶有花絲，則很多花藥膨大很明顯(見封二圖6～7)，甚至在花藥的某個(gè)部位劇烈膨漲，呈半透明狀，這些花藥最終褐化死亡，沒有胚狀體產(chǎn)生，所以在接種時(shí)盡量去掉花絲.改良Keller與其他兩種培養(yǎng)基最明顯的差別在于Keller配方中大量元素的含量低，有機(jī)成分含量很高，在試驗(yàn)中，三種培養(yǎng)基在蔗糖濃度上也有較大差別，出胚率的差異是由哪個(gè)因素造成還有待進(jìn)一步研究.

通過(guò)比較不同預(yù)冷時(shí)間對(duì)花藥培養(yǎng)過(guò)程中出胚率的影響，得出4℃處理花蕾3 d最好，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果比較一致.4℃處理3 d出胚率最高，但3 d內(nèi)對(duì)出胚率的影響差異不大，所以低溫處理更實(shí)際的用途在于暫時(shí)保存花蕾，低溫處理時(shí)間超過(guò)5 d，花蕾萎蔫對(duì)出胚不利.

通過(guò)比較是否添加6-BA和NAA對(duì)出胚率的影響，得出激素的添加不利于花藥的出胚，這可能與添加的激素種類、濃度不合適有關(guān)，也可能是由于激素的添加導(dǎo)致體細(xì)胞增殖，消耗了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和花藥本身的內(nèi)源物質(zhì)，抑制了小孢子的脫分化或發(fā)育進(jìn)而影響了出胚.激素對(duì)出胚率的影響還有待進(jìn)一步研究.

[1] 陳玉萍，田志宏，陳愛武,等.包心芥菜游離小孢子培養(yǎng)的初步研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1998，17(1)：97-99.

[2] 劉冬，郭平仲，劉凡,等.芥菜(Brassica juncea L.)小孢子胚發(fā)生和植株再生[J].首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,1997,18(1)：79-84.

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[8] 袁惠燕，侯喜林.溫度預(yù)處理對(duì)不結(jié)球白菜雜種F1花藥培養(yǎng)[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,31(4):144-148.